CN119490959A 一种快速制备car-t细胞的方法 （上海恒润达生生物科技股份有限公司）

司本发明涉及快速制备嵌合抗原受体T细胞含T细胞的细胞群体与刺激试剂接触以活化T细的细胞群体与编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分后收获，冻存或不冻存。本发明方法大幅缩短22)使所述活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群体与编码嵌合抗原受体(CAR)的核a)步骤1)包括：从新鲜PBMC或冻存的PBMC分选获得所述T细胞或包含T细胞的细胞群b)所述刺激试剂包括一种或多种能够活化TCR复合物的细胞内信号传导结构域的成c)步骤2)得到表达CAR的嵌合抗原受体T细胞的方法选自病毒介导的转导或非病毒介3优选地，所述培养的培养基含有IL_2，更优选地，其浓度为50_500IU/ml、优选100_4用基因工程改造T细胞，使细胞表面表达识别肿瘤恶性细胞特异性抗原的CAR分子，引导[0006]2)使所述活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群体与编码嵌合抗原受体(CAR)[0009]在一个或多个实施方案中，所述刺激试剂包括一种或多种能够活化TCR复合物的5[0015]在一个或多个实施方案中，CD3+细胞活化培养的起始细胞密度为1_5×1[0016]在一个或多个实施方案中，步骤1)活化培养的培养基为AIM_V、X_VIVO、DMEM、[0018]在一个或多个实施方案中，步骤1)活化培养的培养条件是约37℃及约5％CO2环优选地，所述共同培养的培养基含有IL_2，更优选地，其浓度为50_500IU/ml、优选100_[0021]在一个或多个实施方案中，步骤3)所述培养的培养基为AIM_V、X_VIVO、DMEM、[0023]在一个或多个实施方案中，步骤3)所述培养的培养条件是约37℃及约5％CO2环[0024]在一个或多个实施方案中，步骤3)第二次收获后不再进行嵌合抗原受体T细胞的[0027]在一个或多个实施方案中，所述细胞外靶抗原结合结构域为靶向CD19的单链抗6[0030]本发明还提供由以上任一实施方案的方法制备获得的CAR_T细胞在制备治疗癌症2PO42HPO4[0042]培养基：本文所述培养基包括适用于免疫细胞(特别是CD3+细胞及其他种类白细7[0044]CTSDynabeadsCD3/28：CTSTMDynabeadsTMCD3/CD28适用于人类T细胞的体外分细胞群体；2)使所述活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群体与编码嵌合抗原受体[0047]在一个或多个实施方案中，所述嵌合抗原受体(CAR)含有细胞外靶抗原结合结构质的两个域之间存在的氨基酸区段，并且可以允许蛋白质的柔性和两个域的彼此相对运抗体)的铰链区也可用于本文所述的嵌合抗原受体。非天然存在的肽也可用作本文所述的嵌合抗原受体的铰链区。示例性地，CAR的铰链区选自CD8α铰链区、IgD铰链区、IgG1Fc本发明的CD8α铰链区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8α铰链区序列。在一些实施方案领域常用于CAR的各种人CD28跨膜区序列。[0051]胞内共刺激结构域通常来自于CD28家族(CD28,ICOS)或者肿瘤坏死因子受体家族8[0052]胞内信号转导结构域负责表达嵌合抗原受体的免疫效应细胞的至少一种正常效[0054]在一个或多个实施方案中，所述CAR的细胞外靶抗原结合结构域为抗CD19的单链抗体。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体包括选自以下的CDR序列：QDISKY中，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7第1_107位氨基酸所[0056]在一些实施方案中，T细胞或包含T细胞的细胞群体为血液样品或血液来源的样9集后的产物包括单独的或呈组合方式的CD4+T细胞和/或CD8+T细胞。在一个或多个实施方案中，所述T细胞或包含T细胞的细胞群体包含T细胞和/或CD4+T细胞和/或CD8+T细胞的一胞、效应T细胞(TEFF)、记忆T细胞及其亚型(诸如干性中枢记忆T细胞(stemcentral膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节性T(Treg)细胞、辅助T细胞(诸如TH1细胞)或树突状细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导多能干(iPS)细胞或源自iPS细胞的细达(例如，诱导一种或多种靶基因的突变)分化而成的T细胞(未结合抗体或结合配偶体的那些细胞分选。这样的分选步骤可以基于阳性选择和/或阴性抗体或结合配偶体的细胞被保留。分选不需要获得100％的富集或去除特定的细胞群体或[0061]在一个或多个实施方案中，所述刺激试剂包括一种或更多种能够活化TCR复合物[0062]使所述活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群体与编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸分子接触，意在引入基因工程化组分CAR。可实现基因转导的各种方法是本领域熟知[0065]1)将T细胞或包含T细胞的细胞群体与偶联抗CD3抗体和抗CD28抗体的磁珠接触，[0066]2)洗涤步骤1)活化培养完成后得到的活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群具有如SEQIDNO:7第1_107位氨基酸所示的轻链可变区中的三个CDR，所述抗CD19单链抗体的重链可变区具有如SEQIDNO:7第123_242位氨基酸所示的重链可变区[0070]本公开还提供所述CAR_T细胞在制备治疗癌症的药物中的应用。在一些实施方案内膜癌。细胞的细胞群体与刺激试剂接触以活化T细胞，得到活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群体；2)使所述活化的T细胞或包含活化的T细胞的细胞群体与编码嵌合抗原受体(CAR)[0073]在一个或多个实施方案中，所述CAR的细胞外靶抗原结合结构域为抗CD19的单链抗体。在一个或多个实施方案中，所述抗CD19单链抗体包括选自以下的CDR序列：QDISKY中，所述抗CD19单链抗体的轻链可变区的氨基酸序列如SEQIDNO:7第1_107位氨基酸所[0075]在一个或多个实施方案中，步骤3)和步骤4)之间不包括额外的嵌合抗原受体T细T细胞的细胞群体来自符合采集规程及运输方式的机采单采血，获得单采血的处理方式如[0079]单采血的采集及运输。使用血细胞分离机(COBE®Spectra、Spectraoptia8、TrimaAccel8、FenwalTMAmicus@或等同设备的标准机采设备)，在临床中心病区进行白细胞及血浆的采集分离。单采血采集量约为20mL～200mL，血浆量约为20mL~度梯度离心法并执行仪器制造商开发的NeatCell程序以分离PBMC。将PBMC重悬于DPBS中，CD3+细胞密度(4_10×106CD3+cells/mL)。加入以DPBS清洗过的共价偶联抗_CD3和抗_CD28介素2的X_VIVO15)重悬CD3+细胞(1_5×106cells/mL)并转移至细胞培养瓶或细胞培养袋[0085]在本公开的方法中，接着进行逆转录病毒转导T细胞：首先在37℃环境下以RetroNectin工作液包被细胞培养瓶或细胞培养袋，包被完成后将培养瓶或培养袋中上清弃去。将活化培养完成的CD3+T细胞经一次洗涤后，以含IL_2培养基(添加乙酰半胱氨酸、胞计数。以含50_500IU/mlIL_2培养基调整细胞活化培养18_24小时后收获(此时间点收获的细胞为72hDASHCAR_T细胞)。本工序目的为短CAR_T细胞总制备时长的同时显著提升CAR氮中长期保存(48hDASHCAR_T细胞)。剩余的细胞以含IL_2培养基调整为0.5×106个细[0101]DASHCAR_T细胞和延长培养的CAR_T细胞在冻存前进行检测，结果如图1所示。率较低是由于CAR蛋白转运至细胞表面需一定的时长，而48hDASHCAR_T收获的时间点早于CAR蛋白完全表达于细胞表面。总细胞群体中的CD14及CD16+/CD56+的表达比例趋近皆T细胞，而延长培养的CAR_T细胞中naiveT细胞比例已低于2％。CD45RO_/CCR7+所代表的优秀的扩增及肿瘤杀伤能力。[0103]将冻存后的DASHCAR_T细胞和延长培养CAR_T细胞在37℃水浴中复苏，以含IL_2的48HDASHCAR_T细胞的CAR感染率持续上升；同时可以佐证48hDASHCAR_T即使在收获DASHCAR_T细胞的CD107a表达与延长培养CAR_T细DASH72抑制作用，检测一次小鼠外周血中的T细胞及CAR_T细胞数量评估T/CAR_T细胞的体内扩增细胞的扩增(p<0.0001)；DASH48hCAR_T中低剂量组的肿瘤抑制率与传