（正式版）DB13∕T 5524-2022 《抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定 SSR 分子标记法》

13I2抗豆象绿豆品种真实性和纯度鉴定SSR分子标记法下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本GB/T3543.1农作物种子检验GB/T3543.2农作物种子检验GB/T3543.5农作物种子检验规程真实性和品种纯度GB/T6682分析实验室用水规格和绿豆象(CallosobruchusCh在人工接种豆象鉴定的条件下，种子被害率小于65%的绿品种在特征特性方面典型一致的程度，用与供检品种标准特征特性表现一致的本品种的种子数SSR分子标记（SimpleSequenceRepeatsM也称为微卫星DNA(MicrosatelliteDNA)标记，是基于单个微卫星位点的重复单元在数量上的变异而发展起来一种分子标记。微卫星中重复单位的数目在不同材料中存在高度变异，但其两侧的序列一般是相对保守的单拷贝序列，根据这一特征设计引物进行PCR扩增，从而可以将单个微卫星位点扩增出来。由于重复单元的重复数目不同就产生扩从大量引物中筛选出的一组扩增稳定、多态性较好、带型分布合理、能够用于区分不同材料遗34.1仪器设备十六烷基三甲基溴化铵(CTAB);氯化钠；三氯甲烷(氯仿);异戊醇；β-巯基乙醇；三羟甲基氨基甲烷(Tris碱);37%浓盐酸；乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA-2H₂0);氢氧化钠；硼酸；40%非变性聚丙烯酰胺母液(19:1);四甲基乙二胺(TEMED);过硫酸铵；硝酸银；甲醛；乙醇。5样品6.1.5重复步骤6.1.4一次。150μL灭菌ddH₂0或1×TE(配方见表B.4),置65℃水浴锅溶解1h。46.1.7取出离心管，放置至室温，10000r/min离心2min,将上清液吸取到新的1.5mL离心管DNA模版(20ng/μL)41反向引物(2μmol/L)14总体积注：2×UTaqPCRMasterMix包含UtaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液，浓度为2×,含溴酚蓝和二甲苯程序设定反应时间备注123不同SSR引物所需的退火温度有差异472℃延伸5672℃延伸5marker（最小片段100bp）作为扩增片段大小的指示标记W；电泳时间根据扩增产物大小进行调整，一般可在二甲苯青指示剂条带刚刚跑出胶板时停止电泳。下板后将凝胶从玻璃板上取下，用蒸馏水冲洗凝胶1～2次，以洗掉残留的电泳缓冲液。用终浓度为0.1%（w/w）的AgNO3染色液染色1用蒸馏水冲洗凝胶1～2次，然后使用1.5%（w/w）NaOH（引物从标准样品和检测样品中扩增出的条带数及其分子量大小，按“有”对应条带记录为“1”，“无”对应条带记录为“0”的方法记录每对SSR引物的PCR扩增结果。在引物等位变异片段大小范围内异性扩增还是新增的稀有等位变异。采用单个个体扩增的产物，出现3种或3种以上的多带则为非特异性扩增；采用混合试样提取的，某些位点出现3种或3种以上的谱带，则需要通过单个个体进行甄利用附录A中30个SSR标记对样品和标准样品电泳分析的结果，计算差异位点数量，核实差异位点编号。检测结果用样品和标准样品比较的位点差异数表示。若在所检测检测结果使用正常个体数目（检测试样总数减去非典型个体数目）占检测试样总数的百分率表6b)通过对引物，使用混合试样，采用8%（w/w）非变性聚丙烯酰胺测，与标准样品比较检测出差异位点个，差异位点7表A.1规定了30对绿豆SSR核心引物及相关序号1723425967689928553958序号64318A54534G21Mchr5-5注：标记syd404和Mchr5-163与绿豆抗豆象基因紧密连锁9~42mL表