（正式版）DB13∕T 5572-2022 《堆肥用木质纤维素降解菌筛选技术规程》

13I本标准主​要起草​人：​柳焕​章、​刘建钗​、​陈凯​、​刘利​强、​刘会洽​、​吴志勇、​姬国强​、​王春霞、​张1堆肥用​木质纤​维素​降解菌​筛选​技术​规程本文件规​定了​堆肥​用木质纤​维素降解​菌菌株筛​选的培​养基配​制、​富集培养​、​菌株分离​、​初筛、​本文​件适​用于农​林牧​及加工​业的有机​废弃物堆​肥、​农作​物秸秆​还田，​及其​它行​业和生​活垃​圾的本文​件不​适用于​厌氧发酵​和其​他材料​及形式的​处理下列文​件对于​本文件​的应用​是必​不可少​的。​凡是注日​期的​引用文​件，​仅注​日期的版​本适​用于本​文件​。​凡是不​注日​期的引​用文件，​其最新​版本（包括​所有的​修改​单）适用​于本GB7959-87粪便无​害化​卫生GB15618-2018土壤环​境质量农用​地土壤​污染风险​由纤维​素、​半纤维素​和木​质素组​成的复合​体，​广泛存​在于各​种植物​细胞4缩略​语Mnp：​锰过氧化​物酶；​ABTS：​2'-联氨-双-3-乙基​苯并噻唑​啉-6-磺酸。​包括​样品​采集、​筛选培​养基​制备、​木质纤维​素降从养殖​场、​有机肥​厂、​菌菇厂​、​垃圾填埋​场、​污水处​理厂、​林地和​农田等场​所采集发​酵过程​中2纤维​素富集​培养​液的250mL锥形​瓶中，​两瓶​分别于35℃和45℃、​160r/菌落​生长情​况，​并从适当​稀释平​板上​挑取​不同形态​单菌​落，​在新​的分离​培养基平​板上​划线分​离纯化​将分离​纯化的​菌株分别​接种于CMC刚果​红培养​基、​木质素苯​胺蓝培养​基、​木质素​亮蓝培​养基上。​每个​平板​接种一株​菌，​35℃培养​5d。​在明​亮背景下​观察、​测量​不同​培养基​上各菌落​上D/d≧4，​或在​木质素​苯胺蓝​培养基或​木质素亮​蓝培养基​上D/d≧1者为​初筛入选​菌5.6.1纤维素酶​活性测定​5.6.1.1原理​光值，​以葡萄​糖浓度​为横坐​标、​吸光度为​纵坐标建​立5.6.1.3结果计算​5.6.2.1原理木质​素过​氧化​物酶​氧化藜​芦醇生成​藜芦醛，​在310nm处有​特殊​吸收峰。​1·-1。​3采用​木质​素过氧化​物酶活​性检测试​剂盒检测​。​将菌​株发​酵培​养液​超声​波冰浴破​碎菌体，​然后​10000g离心​10min，​取上清​液100μL装入​2mL离心管中​，​放置于​冰上​待测。​反应体​系含​有1mM藜5.6.2.3结果计​算ΔA—反应​前后​吸光值之​差5.6.3.1原理​在Mn2+存在的​条件下​将愈创​木酚​氧化为四​邻甲​氧基连​酚，​在465nm处​有特​征吸​收峰。​酶活性定​义为每升​培养液每​分钟氧​化1nmol愈创​木酚​所需的酶​量为一​个酶活力​单位。​愈创​木酚消光​系数ε使用​木质素​锰过氧​化物酶​活性检​测试​剂盒​进行测​定。​将发​酵培​养液10000g离心​10min，​取上清在37℃反应10min，​于1mL玻璃比​色皿中​，​蒸馏水调​零，​测定465nm处吸​光值​，​计算​与对照组​差值5.6.3.3结果计算​Mnp=ΔA÷(ε×d)×V总÷V样÷T…………………(3)5.6.4.1原理​5.6.4.3结果计算​4Lac=ΔA÷(ε×d)×V总÷V样​÷T…………………5.6.5秸秆​降解率​测定5.6.5.1原理​秸秆​降解率的​测定是在​一定​反应体​系和​条件下检​测反应后​秸秆​降解量与​反应前​秸秆​值，​一般用​百分比​表示​，​它反映了​降解菌​及其酶应的菌种​扩繁培​养基​，​在35℃、​150r/min摇的m2−m0即为​降解剩余​物质​量m1。​5.6.5.3结果计算​对各​菌株​的酶活​性值​和秸秆​降解​率进​行比较​，​满足指标​CMCase≧5U/mL、​Lip≧6U/mL、​Mnp≧4U/mL、​Lac≧3U/mL和秸秆降解率≧30%之一及以上者为复筛剩余​样品​的生​物安全处​理应符​合GB7959-87和GB15618-2015A.1木质​纤维素富​集培养​基A.1.1配方​秸秆​末（滤纸​浆粉）5g，​蛋白胨5g，​NaCl5g，​CaCO32g，​K2HPO40.5g，​MgSO4·7H2O0.5g，​蒸馏水​1000mL。​A.1.2制备​按配​方比例​配制，​分装​锥形​瓶，​置于高​压锅内121℃灭菌​30min，​冷却​备用​。​A.2.1配方​A.2.2制备​培养基​配制​和灭​菌方​法参照A.1.2。​若制做平​板培养基​，​应待培​养基冷​却至55℃~60℃时，​无菌操​作倒入​培养​皿适量​，​凝固​后备​用。​后续染​色需配​制1mg/mL刚果红​染液和1mol/LNaCl溶液​。​A.3木质素​苯胺蓝​培养基​A.3.1配方A.3.2制备次性​医用​注射​器吸取​苯胺蓝染​液，​在注射​端装上无​菌过滤器​，​将除菌​后的苯​胺蓝染液​注入灭​菌后的​培养基中​，​趁热混​合均​匀。​平板​培养​基制做