免疫学原理与技术（第2版）课件 第7、8章 经典免疫学技术、免疫标记技术

第七章

经典免疫学技术第七章经典免疫学技术第一节沉淀反应第二节凝集反应第三节补体参与的抗原抗体反应第四节中和反应第七章经典免疫学技术第一节沉淀反应第二节凝集反应第三节补体参与的抗原抗体反应第四节中和反应沉淀第一节沉淀反应一、沉淀反应的原理二、沉淀反应的类型第一节沉淀反应一、沉淀反应的原理二、沉淀反应的类型一、沉淀反应的原理沉淀反应（precipitation）：

可溶性抗原与相应抗体在溶液或凝胶中特异性结合后，如两者比例合适时，可相互作用形成不溶性的免疫复合物，出现肉眼可见的不溶性沉淀物。沉淀原（precipitinogen）沉淀素（precipitin）沉淀反应曲线第一节沉淀反应一、沉淀反应的原理二、沉淀反应的类型二、沉淀反应的类型

（一）溶液中沉淀反应

（二）凝胶中沉淀反应

二、沉淀反应的类型

（一）溶液中沉淀反应

（二）凝胶中沉淀反应

（一）溶液中沉淀反应

是指在清彻透明的液体中，呈溶解状态的抗原与抗体在试管内或凹玻片上混匀，可凝聚成为肉眼可见的絮状或颗粒状的不溶性沉淀物。

盐溶液抗原+抗体

沉淀

20~56℃、pH6～8

抗原：沉淀原抗体：沉淀素（一）溶液中沉淀反应1.絮状沉淀反应2.环状沉淀试验3.免疫比浊法免疫沉淀技术免疫共沉淀技术（一）溶液中沉淀反应1.絮状沉淀反应2.环状沉淀试验3.免疫比浊法免疫沉淀技术免疫共沉淀技术1.絮状沉淀试验

（flocculoreaction）

即将抗原与相应抗体混合，在适当电解质存在的条件下，抗原抗体结合形成肉眼可见的絮状沉淀物。特点：方法受抗原抗体比例的影响非常明显应用于测定抗原抗体反应的最适比例絮状沉淀试验是抗原与抗体最适比例的基本测定方法抗原稀释法：抗原最适比例抗体稀释法：抗体最适比例方阵滴定法：抗原抗体最适比例絮状沉淀试验的三种方法最适比方阵测定法抗体稀释度抗原稀释度1/101/201/401/801/1601/3201/640对照1/5++++++++++++±—1/10+++++++++++++—1/20+++++++++++++—1/40—±+++++++++—1/80————+++—（一）溶液中沉淀反应1.絮状沉淀反应2.环状沉淀试验3.免疫比浊法免疫沉淀技术免疫共沉淀技术2.环状沉淀试验

（ringprecipitationtest）

Ascoli于1902年建立的方法，又称毛细管内沉淀反应用于检查兽类内脏、毛皮浸液等标本中的炭疽杆菌抗原2.环状沉淀试验

（Ringprecipitationtest）

Ascolireaction（一）溶液中沉淀反应1.絮状沉淀反应2.环状沉淀试验3.免疫比浊法免疫沉淀技术免疫共沉淀技术3.免疫比浊法

（immunonephelomytry）优点：校正曲线稳定简便快速易于自动化无放射性核素污染缺点：特异性、灵敏度稍差免疫比浊法的分类（1）透射比浊法（transmissionturbidimetry）（2）散射比浊法（nephelometry）（3）免疫胶乳浊度测定法（immunolatexturbidimetry）（4）速率抑制免疫比浊法（rateinhibitionimmunoturbidimetry）（一）溶液中沉淀反应1.絮状沉淀反应2.环状沉淀试验3.免疫比浊法免疫沉淀技术免疫共沉淀技术4.免疫沉淀技术

（Immunoprecipitationassay）（一）溶液中沉淀反应1.絮状沉淀反应2.环状沉淀试验3.免疫比浊法免疫沉淀技术免疫共沉淀技术5.免疫共沉淀技术

（Co-Immunoprecipitationassay）结果分析NatureCellBiology19,362–374(2017)GSTpull-down技术结果分析PNAS,2008vol.105no.82836-2841基因转录调控染色质免疫共沉淀染色质免疫共沉淀结果分析MolCancerTherJune2010vol.9no.61764-1774免疫沉淀中抗体的选择免疫共沉淀的优点检测细胞内相互作用蛋白质的天然活性检测真实细胞环境中的蛋白质相互作用获得天然状态下的相互作用蛋白质复合物免疫共沉淀的局限性难以检测低亲和力和短暂的相互作用不能够确切分辨第三种蛋白的桥联作用灵敏度不如亲和色谱高需对未知蛋白的相关信息有一定了解免疫共沉淀技术的应用应用范围蛋白质相对含量检测蛋白质修饰水平分析蛋白质相互作用研究二、沉淀反应的类型

（一）溶液中沉淀反应

（二）凝胶中沉淀反应

（二）凝胶中沉淀反应1.单相免疫扩散试验2.双相免疫扩散试验3.免疫电泳4.火箭电泳试验5.免疫印迹技术（二）凝胶中沉淀反应1.单相免疫扩散试验2.双相免疫扩散试验3.免疫电泳4.火箭电泳试验5.免疫印迹技术1.单相免疫扩散试验

（singleimmunodiffusion）（二）凝胶中沉淀反应1.单相免疫扩散试验2.双相免疫扩散试验3.免疫电泳4.火箭电泳试验5.免疫印迹技术2.双向免疫扩散试验

（doubleimmunodiffusion）2.双向免疫扩散试验

（doubleimmunodiffusion）（二）凝胶中沉淀反应1.单相免疫扩散试验2.双相免疫扩散试验3.免疫电泳4.火箭电泳试验5.免疫印迹技术3.免疫电泳

（immunoelectrophoresis）（二）凝胶中沉淀反应1.单相免疫扩散试验2.双相免疫扩散试验3.免疫电泳4.火箭电泳试验5.免疫印迹技术4.火箭免疫电泳

（Rocketimmunoelectrophoresis）交叉免疫电泳

（Crossedimmunoelectrophoresis）ImmunofixationElectrophoresis(IFE)（二）凝胶中沉淀反应1.单相免疫扩散试验2.双相免疫扩散试验3.免疫电泳4.火箭电泳试验5.免疫印迹技术5.免疫印渍技术

（ImmunoblottingorWesternblotting）蛋白的分离免疫印迹技术免疫印迹应用第七章经典免疫学技术第一节沉淀反应第二节凝集反应第三节补体参与的抗原抗体反应第四节中和反应第二节凝集反应一、凝集反应的原理二、凝集反应的类型第二节凝集反应一、凝集反应的原理二、凝集反应的类型一、凝集反应的原理凝集反应（agglutination）：

颗粒型抗原与相应抗体结合，在适当电解质存在下，形成肉眼可见的凝集团块。凝集原（agglutinogen）凝集素（agglutinin）凝集反应特点凝集反应中抗原颗粒较大抗原，长期静置或离心沉淀可自然下沉凝集反应中凝集块主要由抗原形成，而在沉淀反应中，沉淀物主要由抗体形成在凝集反应中，需稀释免疫血清中的抗体，使抗体不致于过多；而在沉淀反应中，为了不使抗原过多则需稀释抗原第二节凝集反应一、凝集反应的原理二、凝集反应的类型二、溶液中沉淀反应1．直接凝集反应2．间接凝集反应3．桥梁凝集反应4．共同凝集反应二、溶液中沉淀反应1．直接凝集反应2．间接凝集反应3．桥梁凝集反应4．共同凝集反应1．直接凝集反应

（directagglutination）

是将细菌或红细胞与其相应抗体结合产生的细菌凝集或红细胞凝集现象。（1）微生物凝集反应（2）同种红细胞凝集反应

（1）微生物凝集反应肥达氏反应（Widalreaction）：

用已知的伤寒杆菌O、H抗原和甲、乙型副伤寒杆菌H抗原，与病人血清作定量凝集试验，以测定患者血清中无相应抗体存在，作为伤寒、副伤寒诊断的参考。（2）同种红细胞凝集反应

红细胞凝集反应二、溶液中沉淀反应1．直接凝集反应2．间接凝集反应3．桥梁凝集反应4．共同凝集反应2．间接凝集反应

（indirectagglutination）

将可溶性抗原（或抗体）包被在不溶性颗粒表面，与相应抗体（或抗原）在适宜条件下结合形成凝集团块。反应类型（1）正向间接凝集反应（2）反向间接凝集反应（3）间接凝集抑制反应

（1）正向间接凝集反应

（forwardindirectagglutination）将抗原先吸附在载体表面，然后与相应抗体结合产生的凝集反应。（2）反向间接凝集反应

（reverseindirectagglutination）将特异性抗体先吸附在载体表面，然后与相应抗原结合产生的凝集反应。

此方法对检测微量抗原具较高敏感性。由于病原体的抗原成分一般比血清抗体出现早，可用于检测如钩端螺旋体抗原、乙肝表面抗原HBsAg或原发性肝癌AFP等。（3）间接凝集抑制反应

（indirectagglutinationinhibitiontest）二、溶液中沉淀反应1．直接凝集反应2．间接凝集反应3．桥梁凝集反应4．共同凝集反应桥梁凝集反应

二、溶液中沉淀反应1．直接凝集反应2．间接凝集反应3．桥梁凝集反应4．共同凝集反应4．共同凝集反应

（indirectagglutinationinhibitiontest）

又称协同凝集反应。指由两种颗粒成分相互作用而发生的凝集反应。（1）细菌共同凝集反应（2）玫瑰花结试验细菌共同凝集反应（2）玫瑰花结试验淋巴细胞与红细胞形成

玫瑰花结的主要模式玫瑰花结的类型红细胞的类型及处理淋巴细胞类型E花结绵羊红细胞T、50%NKEA花结抗体致敏的红细胞B、T、NK、粒细胞、单核细胞及巨噬细胞EAC花结补体致敏的红细胞B第七章经典免疫学技术第一节沉淀反应第二节凝集反应第三节补体参与的抗原抗体反应第四节中和反应第三节补体参与的抗原抗体反应一、补体参与抗原抗体反应的原理二、补体参与抗原抗体反应的类型第三节补体参与的抗原抗体反应一、补体参与抗原抗体反应的原理二、补体参与抗原抗体反应的类型一、补体参与抗原抗体反应的原理

利用补体来检测反应体系中抗原抗体的存在情况，并通过红细胞的裂解与否进行示踪。第三节补体参与的抗原抗体反应一、补体参与抗原抗体反应的原理二、补体参与抗原抗体反应的类型二、补体参与抗原抗体反应的类型1．补体参与直接的抗原抗体反应2．补体参与间接的抗原抗体反应二、补体参与抗原抗体反应的类型1．补体参与直接的抗原抗体反应2．补体参与间接的抗原抗体反应1．补体参与直接的抗原抗体反应（1）溶血反应（2）溶菌反应（1）溶血试验

（hemolyticassay）1942年Rutstein和Walker建立了血清中总补体活性的测定方法。能使反应体系中50%的致敏绵羊红细胞发生溶血的血清的量，即为每毫升血清中补体的含量。每毫升补体含量（单位）=1/血清用量×稀释倍数（2）溶菌反应

溶菌反应常作为某血清中是否存在相应抗体的检测方法。二、补体参与抗原抗体反应的类型1．补体参与直接的抗原抗体反应2．补体参与间接的抗原抗体反应2．补体参与间接的抗原抗体反应

（1）补体结合试验（2）被动红细胞溶解试验（3）溶血空斑试验（1）补体结合试验

（complementfixationtest，CFT）

1901年由Bordet和Gengou建立1906年Wasermann应用于梅毒诊断，即华氏反应溶血素溶血素补体结合试验（2）被动红细胞溶解试验

（passivehemolysistest）

即吸附抗原的红细胞在有相应抗体和补体存在时，出现红细胞溶解反应。抗原致敏红细胞

加入待测血清和补体

判断结果（阳性对照：加入相应抗体和补体）（3）溶血空斑试验

（hemolyticplaqueassay，HPA）

是测定B淋巴细胞产生和分泌抗体功能的一种体外试验方法。直接溶血空斑试验间接溶血空斑试验改良型溶血空斑试验反向溶血空斑试验直接溶血空斑试验间接溶血空斑试验间接法一般用于测定溶血效率较低的IgG或IgA型抗体，反应过程中需要加入抗球蛋白抗体辅助溶血空斑的形成。改良型溶血空斑试验反向溶血空斑试验第七章经典免疫学技术第一节沉淀反应第二节凝集反应第三节补体参与的抗原抗体反应第四节中和反应第一节沉淀反应一、中和反应的原理二、中和反应的类型第一节沉淀反应一、中和反应的原理二、中和反应的类型一、中和反应的原理

中和反应（neutralizationtest）：

即将被检血清与病原微生物混合，经适当时间作用后，接种于宿主系统（包括动物、鸡胚或培养细胞），按照对其产生的保护效果的差异，可判断该微生物或毒素是否已被中和，并计算出中和的程度。中和抗体：能与病毒结合，使其失去感染力的抗体抗毒素：能与细菌外毒素结合，中和其毒性作用的抗体中和反应的特点检测机体内是否存在中和抗体及其效价，直接反应机体抗病毒的能力，有利于临床诊断；中和抗体在体内存留时间一般较长，可用于流行病学调查；中和反应有严格的种、型特异性，可对分离的病毒进行准确的分类鉴定。缺点：操作麻烦，试验时间较长。第一节沉淀反应一、中和反应的原理二、中和反应的类型二、中和反应的类型1．终点法中和反应2．蚀斑减少法中和反应二、中和反应的类型1．终点法中和反应2．蚀斑减少法中和反应1．终点法中和反应

根据滴定被血清中和后的残余毒力，来判断血清中中和抗体的效价。（1）固定病毒稀释血清法（2）固定血清稀释病毒法中和指数=试验组LD50/对照组LD50（1）固定病毒稀释血清法

先固定病毒的毒价，再与等量的递进稀释的待测血清混合，每一稀释度接种动物（或鸡胚、培养细胞），接种后记录每组动物（或鸡胚）的存活数和死亡数（或培养细胞破坏程度），然后中和指数。（2）固定血清稀释病毒法

将病毒原液作10倍递进稀释，分别与等量正常血清（对照组）、待测血清（试验组）混合，每一稀释度接种动物（或鸡胚、培养细胞），接种后记录每组动物（或鸡胚）的死亡数（或培养细胞破坏程度），然后计算其中和指数。二、中和反应的类型1．终点法中和反应2．蚀斑减少法中和反应2.蚀斑减少法中和反应1952年Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于病毒学研究，创造了病毒蚀斑技术（virusplaqueformation），为病毒学研究的基本方法。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感染细胞，再与营养琼脂混合后铺板并培养，数天后统计蚀斑数。抗体效价为：蚀斑数减少50％的血清稀释度新冠病毒的抗体中和实验TheprotectionefficiencyofMAbsinhACE2micemodelpostinfectionwithCOVID-19virusScience，2020免疫学检测技术的发展免疫学检测技术特异性灵敏度便利性稳定性第八章

免疫标记技术经典免疫学技术的不足灵敏度周期长可重复性无法定量无法定位特异性差关键问题免疫标记技术

（immunolabellingtechnique）用荧光素、放射性同位素、酶、发光剂或电子致密物质等作为示踪剂，标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。免疫标记技术分类：免疫酶技术(ng)、放射免疫技术(pg)、免疫荧光技术、免疫电镜技术、免疫胶体金技术、发光免疫测定。特点：高度灵敏、特异、快速，定性、定量、定位第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术一、放射免疫技术二、免疫放射技术第一节 放射免疫技术一、放射免疫技术二、免疫放射技术第一节 放射免疫技术（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术放射免疫技术

（radioimmunoassay，RIA）（1977年获诺贝尔生理和医学奖）放射免疫技术的原理RIA是以放射性同位素标记抗原的一种竞争性免疫抑制试验（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（二）放射免疫技术的基本条件1．抗原标准品与待测抗原2．放射性同位素3．特异性抗体4．常用的同位素标记方法5．B与F的分离技术1．抗原标准品与待测抗原

标准品是放免技术的定量依据

标准品：与待测样品的化学结构完全相同

替代品：与待测样品的结构相似，但要与抗体的亲和力相近，应列出与真标准品的换算系数。2.放射性同位素3.特异性抗体放射免疫技术的抗体应具备：特异性高、亲和力高（平衡常数K值大）、效价高（即抗血清高度稀释时仍能迅速与抗原结合，极少解离，保证检测的灵敏度）4.常用的同位素标记方法氯胺T氧化标记法乳过氧化物酶标记法半抗原标记法5.B与F的分离技术（1）双抗体沉淀分离法（2）化学试剂分段沉淀分离法（3）固相法（4）吸附法结合态标记抗原B与游离态标记抗原F能否有效地分离是放射免疫技术的一个重要环节。分离剂的要求

能使B和F完全分离不受外界因素的干扰与游离抗原的非特异性作用尽可能小操作简便、分离迅速、重复性好来源广，经济，便于使用（1）双抗体沉淀分离法优点：

本法操作简便、稳定缺点：

易受免疫反应液中其他蛋白质或盐的干扰，使非特异性吸附有较大变异，且第二抗体消耗量大。

加入第二抗体使微量抗原抗体复合物的分子加大，从而使原来不能用普通离心法沉淀的抗原抗体复合物易于沉淀而分离。

（2）化学试剂分段沉淀分离法

利用盐类或有机化合物使反应液中的

-球蛋白在等电点沉淀，从而达到分离的目的。如：聚乙二醇（PEG）、硫酸铵等优点：试剂来源广泛、价格便宜缺点：

影响因素多（温度、pH值、浓度等）（3）固相法

将测定用的第一抗体（或第二抗体）牢固地结合于固相载体表面，相应抗原（或第一抗体）经温育被吸附，只要将固相表面洗涤即将B和F分离。优点：操作简便、快速新的固相分离方法：纤维固相抗体竞争法可磁化颗粒固相抗体竞争法试管固相法（4）吸附法

本法多用于小分子半抗原的放射免疫分析。如：活性炭、硅镁吸附剂、滑石粉等性质：对蛋白质、多肽、药物等具有非特异性

吸附的能力应用：在其表面包被一层白蛋白或右旋糖苷等

物质时，将会限制大分子物质的吸附。

沉淀中：吸附有游离的抗原或半抗原

上清液中：抗原抗体复合物优点：操作简便、分离迅速缺点：专一性不强（一）放射免疫技术的原理（二）放射免疫技术的基本条件（三）放射免疫技术的基本类型一、放射免疫技术（三）放射免疫技术的基本类型1．液相法（1）平衡法（又称一步法）（2）顺序加样法2．固相法（1）竞争法Ag+Ag*+Ab-（2）改良法

Ag+Ag*+Ab+AntiAb-一、放射免疫技术二、免疫放射技术第一节 放射免疫技术（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术

1986年Miles和Hales建立免疫放射分析技术（immunoradiometricassay，IRMA）

标记抗体作示踪剂，在反应系统中加入过量的抗体，待测物（或标准品）和同位素标记抗体全量反应。优点：灵敏度高（可提高6-10倍）、准确度高、重复性好、检样量少缺点：干扰因素较多、检测仪器贵、有放射性污染免疫放射技术

（immunoradiometricassay，IRMA）（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（二）免疫放射技术的基本条件1．标记抗体的制备

2．固相抗原免疫吸附剂（一）免疫放射技术的原理（二）免疫放射技术的基本条件（三）免疫放射技术的基本类型二、免疫放射技术（三）放射免疫技术的基本类型1.经典IRMA法2.双抗体夹心法二抗标记法双标记抗体法1.经典IRMA法2.双抗体夹心法标记3.二抗标记法4.双标记抗体法双标记抗体是将两种针对不同表位的抗体（Ab2、Ab3）标记上不同的同位素，可以用不同的检测仪进行测定。胰岛素放免试剂盒第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节 免疫荧光技术一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节 免疫荧光技术AlbertHewettCoons（1912—1978）20世纪40年代Coons等首先用荧光素FITC标记抗体，成功地检测了小鼠肺脏组织内存在的肺炎双球菌多糖抗原，从而创建免疫荧光技术（immuno-fluorescencetechnique）。一、免疫荧光技术的原理

三结合：抗原抗体反应的高度特异性荧光的敏感可测性显微技术的高度精确性

优点：特异性强、敏感性高、速度快，结果直观，可以检测和定位微量抗原

缺点：荧光易发生淬灭，荧光染色标本保存困难、易出现非特异性染色问题，镜检结果判定客观性不足一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节 免疫荧光技术1.荧光素2.荧光标记物的制备荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件1.荧光素2.荧光标记物的制备荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件1．荧光素荧光素：可以产生明亮荧光的染色物质荧光素的性质吸收光后电子跃迁保持固有的荧光特性荧光的波长总是大于激发光波长（STOKES法则）荧光强度小于激发光的强度荧光效率=发射光量子数/吸收光量子数×100%荧光强度=吸收光量子数×荧光效率荧光的种类自发荧光二次荧光非特异性荧光：自发荧光诱发荧光酶诱发荧光荧光素选择条件荧光强度高且稳定能轻易与蛋白质分子形成稳定共价键荧光素与蛋白质结合的方法应简便、快速产生的荧光颜色应与自发荧光对比鲜明结合物在一般贮存条件下性能稳定，可保存较长时间荧光素1.荧光素2.荧光标记物的制备荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件荧光标记抗体的制备（1）搅拌标记法（Marshall法）（2）半透膜透析标记法（Clark法）荧光标记抗体的纯化（1）去除游离荧光素（2）去除未标记和过度标记的抗体荧光标记抗体的鉴定（1）抗体与荧光的活性鉴定（2）荧光素与蛋白质的摩尔比值（F/P）

采用紫外分光比色法测定FITC（F）OD值和

蛋白质（P）OD值以后，用以下公式计算F/P比值：

F/P比值=（2.87×OD495）/（OD280—0.35×OD495）（3）荧光抗体浓度的测定（4）荧光抗体特异性的鉴定：特异性吸收试验，竞争抑制试验1.荧光素2.荧光标记物的制备荧光检测仪二、免疫荧光技术的基本条件3.荧光检测仪（1）荧光显微镜（2）荧光分光光度计（1）荧光显微镜透射式落射式透射荧光显微镜原理低倍镜较明亮，高倍镜较暗，在油浸和调中时，较难操作，尤以低倍的照明范围难于确定，但能得到很暗的视野背景。透射式不适用于非透明的被检物体。落射式荧光显微镜激发滤光板位于聚光镜和光源之间，可滤过由荧光灯源发射出的其他光，只允许波长为275～480nm的紫外光（MG）和蓝紫光（BG）通过，以激发荧光结合物发射荧光。汞灯光源:提供激发光(U、V、B、G)激发滤色镜:

波长选择分色镜:反射激发光,透过荧光

吸收滤色镜:透过荧光,阻挡杂光落射荧光显微镜原理对透明和不透明的被检物体都适用。由于物镜起了聚光镜的作用，不仅便于操作，而且从低倍到高倍，可以实现整个视场的均匀照明。（2）荧光分光光度计

用于扫描荧光标记物所发出的荧光光谱的一种仪器。其能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命、荧光偏振等许多物理参数，从各个角度反映了分子的成键和结构情况。一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节 免疫荧光技术1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法补体荧光染色法特殊染色法三、经典荧光抗体染色法1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法补体荧光染色法特殊染色法三、经典荧光抗体染色法1.直接荧光抗体染色法优点：简单、快速、特异性高缺点：检测每种抗原需制备相应抗体、敏感性差将荧光素标记在特异性抗体上，直接检测抗原1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法补体荧光染色法特殊染色法三、经典荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法优点：敏感性高、一种二抗可检测多种抗原抗体系统缺点：干扰因素多、操作流程长将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体肿瘤组织中M2型巨噬细胞1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法补体荧光染色法特殊染色法三、经典荧光抗体染色法3.补体荧光染色法优点：可检测所有抗原抗体系统，具有通用性；敏感性高缺点：操作过程较复杂，干扰因素多，易出现非特异性染色，补体易失活将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。1.直接荧光抗体染色法2.间接荧光抗体染色法补体荧光染色法特殊染色法三、经典荧光抗体染色法4．特殊染色法（1）双标记免疫荧光技术（2）双色免疫荧光技术（3）反衬染色法（1）双标记免疫荧光技术

在同一标本中，可用两种不同颜色的荧光标记抗体进行染色，同时显示两种不同的细胞或同一细胞上不同的抗原。如：FITC（黄绿色荧光）标记Ab1—RB200或TRITC9（桔红色荧光）标记Ab2细胞内双标记荧光染色DAPI+FITCFITC+PI（2）双色免疫荧光技术

如FITC标记抗体和细胞核染色剂PI（红色）DAPI（蓝色）

（3）反衬染色法

是用一种非特异染色来反衬一种免疫荧光试剂的特异性染色。如：用RB200标记BSA作为非特异性反衬标记，用FITC标记特异性抗体。一、免疫荧光技术的原理二、免疫荧光技术的基本条件三、经典荧光抗体染色法四、现代免疫荧光技术第二节 免疫荧光技术1.流式细胞术2.荧光偏振免疫分析技术3.时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术1.流式细胞术2.荧光偏振免疫分析技术3.时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术1.流式细胞术

（FlowCytometry，FCM）荧光激活细胞分类器（fluorescingactivatingcellsorter，FACS）流式细胞仪原理物理参数分析细胞分类单参数数据分析细胞凋亡的检测细胞表面标志鉴定三参数数据分析1.流式细胞术2.荧光偏振免疫分析技术3.时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术2.荧光偏振免疫分析技术

（fluorescencepolarizationimmunoassay，FPIA）利用荧光素经单一波长的偏振光照射后，吸收光能并发射出相应的偏振荧光，其强弱程度与荧光分子的颗粒大小呈正相关。反应系统中同时加入待测药物、一定量的荧光素标记的相应药物（小分子）和抗药物抗体，使待测药物和荧光素标记药物与有限量的特异性抗体（大分子）进行竞争结合。荧光偏振光分析仪Transcreener®UDP2FPAssayFPIA技术特点优点：标本可直接用于测定样品用量少测定时间短精密度高缺点：仪器价格昂贵药品试剂盒专用性强不易普及应用1.流式细胞术2.荧光偏振免疫分析技术3.时间分辨荧光免疫测定四、现代免疫荧光技术3.时间分辨荧光免疫测定

（TrFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点（强度高、衰变时间长），用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。实验原理类线光谱：有利于降低本底荧光强度，提高分辨率较大的Stokes位移：有利于排除非特异荧光的干扰，增强测量的特异性螯合物：荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧光物质对检测结果的影响分析速度快、标记物制备较简便、标记物有效使用期长、无放射性污染、应用范围广等优点第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节 酶免疫技术一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节 酶免疫技术酶催化反应原理酶催化反应的两种基本形式：E+S＝（ES）＝E+PE+S＝（ES）

+D1＝E+P+D2E：酶S：酶作用的底物 P：底物分解后的产物（有色化合物）D1：供氢体 D2：为D1的氧化型（有色化合物）酶免疫技术

（enzymeimmunoassay，EIA）优点：灵敏度高，特异性强，操作简便，易掌握和推广；试剂易制备，且稳定保存期长；结果可肉眼观察，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉。缺点：检测可溶性样品，灵敏度和重复性不及放免疫测定法；免疫组化中，易受细胞内源性酶的干扰，直观性比荧光免疫染色法差。一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节 酶免疫技术二、酶免疫技术的基本条件1．标记酶2．酶标记物的制备3．酶底物的选择4.固相载体的选择5.酶标检测仪二、酶免疫技术的基本条件1．标记酶2．酶标记物的制备3．酶底物的选择4.固相载体的选择5.酶标检测仪1.标记酶辣根过氧化物酶

（horseradishperoxidase，HRP）碱性磷酸酶

（alkalinephosphatase，AP）葡萄糖氧化酶

（glucooxidase，Glu）

-D-半乳糖苷酶

（

-D-galactosidase，

-D-Gal）二、酶免疫技术的基本条件1．标记酶2．酶标记物的制备3．酶底物的选择4.固相载体的选择5.酶标检测仪２．酶标记物的制备

免疫酶结合物： 酶标记抗原的制备 酶标记抗体的制备二、酶免疫技术的基本条件1．标记酶2．酶标记物的制备3．酶底物的选择4.固相载体的选择5.酶标检测仪3.酶底物的选择二、酶免疫技术的基本条件1．标记酶2．酶标记物的制备3．酶底物的选择4.固相载体的选择5.酶标检测仪4.固相载体的选择

ELISA法最常用的固相载体：要求：蛋白质吸附性能强、吸附后不影响抗原抗体的活性、价格低廉、形状可塑聚苯乙烯——吸附性能好、透明度好聚氯乙烯——质软板薄，容易剪割，价廉，吸附性能高于聚苯乙烯，但光洁度稍差、空白值也略高硝酸纤维素膜及微孔滤膜——用于快速斑点免疫结合试验酶标板种类高结合力酶标板（表面处理）400-500ngIgG/cm2MW>10kD

中结合力酶标板（疏水键结合）200-300ngIgG/cm2MW>20kD氨基化酶标板（表面正电荷氨基）100ng/cm2小分子蛋白蛋白的包被（coating）pH9.6的碳酸盐缓冲液4度过夜1%-5%BSAblocking低温保存二、酶免疫技术的基本条件1．标记酶2．酶标记物的制备3．酶底物的选择4.固相载体的选择5.酶标检测仪一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节 酶免疫技术三、免疫酶技术的类型

酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbent，ELISA）酶联免疫吸附试验

（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）1.直接法2.间接法3.夹心法4.竞争法5.抗酶抗体法ELISA的检测类型1.直接法2.间接法3.

夹心法AdditionalMaterialsRequiredTypicalStandardCurve4.竞争法5.抗酶抗体法ELISA实验条件优化蛋白的包被：载体、蛋白浓度、温度、时间封阻：BSA、血清、脱脂奶粉洗涤：生理盐水、PBS、Tris-HCl酶结合物的浓度：标准为OD值≥1.0标本的选择结果判断一、酶免疫技术的原理二、酶免疫技术的基本条件三、酶免疫技术的基本类型四、ELISA方法的发展第三节 酶免疫技术1.酶联免疫荧光测定法2.IgM型抗体捕捉酶联免疫吸附试验3.斑点ELISA4.酶联免疫斑点法四、ELISA方法的发展1.酶联免疫荧光测定法

（enzymelinkedfluorescenceimmunoassay，ELFIA）

荧光底物使ELISA的检测极限提高了几十倍，达到渺克（ag=10-18g）水平2.IgM型抗体捕捉酶联

免疫吸附试验3.斑点ELISA

（dot-ELISA）采用硝酸纤维素膜（NC膜）作为固相载体，将抗原点加于膜上，干燥后以BSA-PBS封闭，然后滴加待检血清和酶标抗体，反应后，滴加底物溶液，当膜上呈现肉眼可见的着色斑点即为阳性反应，本法常作为定性检测。4.酶联免疫斑点法

（enzymelinkedimmunospot，ELISPOT）第八章免疫标记技术第一节放射免疫技术第二节免疫荧光技术第三节酶免疫技术第四节其他免疫标记技术一、生物素-亲和素放大系统二、免疫分析技术中的通用系统——SPA通用系统三、免疫金溶胶技术第四节 其他免疫标记技术一、生物素-亲和素放大系统二、免疫分析技术中的通用系统——SPA通用系统三、免疫金溶胶技术第四节 其他免疫标记技术生物素-亲合素系统

（Biotin-avidinsystem，BAS）1980年，Hsu首先用生物素亲合素化酶进行组织化学研究1983年，Yolken和Kendall首次用BAS与ELISA相结合检测特异性抗原和抗体，并获得成功BSA与酶、同位素、荧光素等标记技术有机结合，可使各种示踪免疫分析的灵敏度进一步提高，可用于微量蛋白分子的定量检测。生物素（biotin，B）生物素分子式为C10H16O3N2S，分子量为244.31，pI为3.5。可从含量较高的卵黄（α型）和肝组织（β型）中提取，也可合成。亲合素（avidin，A）A是卵白蛋白中提取的一种碱性糖蛋白pI10～10.5MW