基于体液游离DNA的肿瘤常见驱动基因高通量测序专家共识总结2026

基于体液游离DNA的肿瘤常见驱动基因高通量测序专家共识总结2026随着高通量测序（nextgenerationsequencing，NGS）技术的不断发展，液体活检，尤其是基于体液中游离DNA（cell-freeDNA，cfDNA）的分子检测在肿瘤诊疗中的应用日益广泛。在临床实践中，受限于患者的体能状态、肿瘤的解剖位置及特定临床情境，组织样本的获取常面临挑战。液体活检因其无创或微创采样方式、可更好反映肿瘤原发灶及转移灶的异质性、可动态监测治疗疗效等优势，临床应用广泛。目前，基于cfDNA的液体活检已广泛应用于肿瘤早筛、晚期患者驱动基因检测、治疗耐药后的基因变异分析，以及微小残留病灶监测等临床实践。本共识重点聚焦基于体液cfDNA的肿瘤常见驱动基因NGS全流程质控环节的标准化及规范化。液体活检的样本除外周血外，还包括胸腔积液、脑脊液、腹腔积液、腹腔灌洗液、尿液及支气管肺泡灌洗液等多种类型的体液标本。本共识专家组在系统梳理国内外新近研究进展并总结临床实践经验的基础上，参考并整合国内已发布的液体活检相关专家共识及技术指南，对不同体液样本的临床检测策略、样本采集与处理规范、NGS检测流程及报告规范等关键环节进行了系统归纳与优化整合，在此基础上形成新的专家共识建议，并据此制定本共识，以期推动我国实体瘤体液cfDNA检测的规范化与标准化应用。对于本共识中提供的推荐意见，采用以下推荐级别进行分类。一、基于体液cfDNA的肿瘤NGS检测概述在肿瘤精准医疗实践中，明确患者的驱动基因变异是指导靶向治疗、免疫治疗及判断预后的关键环节，也是实现个体化治疗的核心。目前，肿瘤组织样本仍是分子检测的“金标准”，但在临床实践中，部分患者获取组织困难：肿瘤位置深、身体状况不佳或存在禁忌证；此外，一些样本因肿瘤细胞含量不足或DNA质量不佳无法满足检测要求。研究显示，10%~30%的实体瘤组织样本不符合NGS质控标准。同时，晚期肿瘤常存在多器官侵犯，加之肿瘤固有的空间异质性，单点组织取样可能无法全面反映肿瘤整体的基因突变图谱，导致关键驱动变异的漏检。组织与血液配对同步检测研究发现，血浆cfDNA检测可额外检出5%~15%的组织样本可能遗漏的驱动变异。体液cfDNA检测可用于晚期实体瘤初治患者关键驱动基因变异的检测，例如在非小细胞肺癌（non-smallcelllungcancer，NSCLC）中检测EGFR、ALK、ROS1、BRAF、MET等基因变异，为靶向治疗或其他特定治疗方案的选择提供分子依据。此外，在疾病进展或既往治疗失败后，体液cfDNA检测在获得性耐药机制的识别中具有重要价值。如NSCLC患者在接受表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR-TKI）治疗后，可通过cfDNA检测EGFRT790M突变、MET扩增等耐药相关改变；在ALK或ROS1TKI治疗后，可通过检测ALKG1202R和L1196M突变，ROS1G2032R和L2026M突变识别继发性激酶结构域突变或旁路激活等新发耐药机制；激素受体阳性、HER2阴性的乳腺癌患者在内分泌治疗后，可通过检测ESR1突变等与内分泌耐药相关的分子异常判断肿瘤对内分泌治疗的耐药状态。上述检测有助于明确耐药分子基础，指导后续治疗策略优化，实现精准、序贯的个体化治疗。多项注册临床试验及真实世界研究已证实体液cfDNA检测可为实体瘤患者的治疗决策提供可靠依据。美国食品药品监督管理局（FoodandDrugAdministration）已批准多项基于血浆cfDNA的NGS检测产品作为实体瘤的伴随诊断应用于临床，为精准用药提供规范化技术支持。随着NGS检测技术的持续发展，除血液外，脑脊液、胸腔积液、腹腔积液及尿液等多种体液标本的分子检测价值已被多数临床研究证实。因此，规范开展体液cfDNA检测具有明确的临床应用价值。推荐意见1：分子检测结果对肿瘤精准治疗至关重要，随着测序技术的发展，体液cfDNANGS检测已成为组织检测的重要补充（1类）。二、不同类型体液样本cfDNANGS检测的临床意义不同类型体液样本cfDNANGS检测在肿瘤精准诊疗中具有重要意义且可以与组织检测结果互补。随着NGS技术的不断发展，大量研究以组织检测为金标准，系统评估了各类体液标本中cfDNA的检测效能，结果均表明其具有良好的灵敏度与特异度。在临床实践中，样本类型的选择应结合患者的病灶分布与转移特点，优先选取预期肿瘤DNA含量较高的体液，以提高检测成功率。如胸膜转移患者可优先选择胸腔积液，广泛腹/盆腔转移患者建议采集腹腔积液，而中枢神经系统转移患者则宜考虑脑脊液。目前，血浆、胸腔积液和脑脊液等常见体液标本的分子检测已积累较充分的研究证据。此外，根据肿瘤类型和转移部位的不同，临床中还可获取腹腔积液、尿液、支气管肺泡灌洗液、支气管灌洗液、痰液及胆汁等多种体液用于检测（表2）。在实际应用中，应结合临床场景、样本可及性以及检测平台的适用范围，合理选择检测标本，以最大程度满足临床需求。1.血浆：血液是液体活检的首选样本类型，在临床应用中具有显著优势。其采集方式微创、便捷，通过常规静脉穿刺即可完成。作为人体循环系统的核心载体，血液能够富集肿瘤细胞在增殖、代谢及凋亡过程中释放的各类生物标志物，为全面解析肿瘤的分子特征提供了重要的载体。血浆样本已广泛应用于肿瘤分子检测，成为组织检测的重要互补手段。多项大规模研究证实了其可靠性。一项纳入3209例Ⅳ期实体瘤患者的多中心研究显示，组织与血浆cfDNA基因检测的总体一致性为66.4%（962/1448），其中结直肠癌达75.0%，前列腺癌为51.2%；该研究同时指出，cfDNA检测灵敏度与肿瘤负荷呈正相关。另一项中国泛癌种队列研究（n>10000）表明，血浆cfDNA检测的总体阳性率为73.5%，在小细胞肺癌（91.1%）和前列腺癌（87.9%）中检出率最高，且其驱动的基因突变谱与组织检测高度吻合。一项纳入1112例NSCLC患者的前瞻性研究显示，血浆cfDNA与组织检测的一致性为72%，且基于cfDNA结果指导的靶向治疗疗效与组织检测相当。BENEFIT研究（CTONG1405）则通过前瞻性干预设计首次证实，基于血浆cfDNA检出的EGFR突变指导EGFR-TKI治疗，其疗效与基于组织检测的结果等效。另一方面，肿瘤患者因穿刺取样的局限性，往往难以反映肿瘤分子特征的全貌。多项研究证实，联合血浆cfDNA检测能有效增加驱动基因的检出。ACCELERATE研究纳入150例疑似肺癌患者，在90例非鳞癌NSCLC患者中，共53例检出可靶向变异；联合检测将驱动基因的检出率从单一组织检测的47%提升至59%。另一项针对323例NSCLC患者的前瞻性研究进一步证实，结合血液cfDNA与组织NGS检测，能够将可靶向治疗变异的检出率从单一组织检测的20.5%提升至35.8%。此外，一项探索NSCLCEGFR-TKI耐药机制的研究发现，在检出EGFRT790M的患者中，约10%的突变仅在血浆cfDNA样本中被捕获。基于以上证据，NSCLC美国国家综合癌症网络（NCCN）指南（V3.2026）建议，在适当的临床情境下可采用组织与血浆cfDNA同步检测，以实现更全面的基因分型。在特定治疗场景中，液体活检更具独特价值。如约40%既往接受内分泌治疗后进展的乳腺癌患者会出现ESR1基因突变，且该突变可在临床进展前通过血浆cfDNA检出。因此，乳腺癌NCCN指南（V2.2026）也推荐优先采用cfDNA检测ESR1突变，以便及时调整治疗方案。推荐意见2：基于现有循证医学证据，对于组织样本无法满足分子检测的晚期肿瘤患者，可选择将血浆cfDNA检测作为重要的替代检测手段（1类）。推荐意见3：血浆cfDNA检测具备检测周期短、受肿瘤异质性影响小等优势，必要时可同步开展组织及血浆cfDNA分子检测，提升驱动基因突变检出率。对于内分泌治疗后复发或进展的乳腺癌患者，血浆cfDNA检测可作为ESR1基因突变检测的优先方案（2A类）。2.胸腔积液：恶性胸腔积液（malignantpleuraleffusion，MPE）是由胸膜原发或继发恶性肿瘤引发的胸腔积液，其中超过1/3的病例由肺癌引起，是肺癌患者预后不良的重要标志之一。MPE经离心处理后可分离为上清液与细胞沉淀。基于MPE细胞沉淀进行驱动基因检测结果与肿瘤组织检测的一致性已经得到证实。近几年的研究进一步表明，与血浆相比，MPE上清液可能富集更多来源于肿瘤的DNA，具有更高的突变检测灵敏度及与肿瘤组织更高的基因变异一致性。Tong等对63例晚期肺癌患者的研究发现，MPE上清中cfDNA浓度显著高于血浆，MPE上清、细胞沉淀以及血浆样本的体细胞突变检出率分别为98.4%、90.5%和87.0%，且MPE上清检测的肿瘤突变负荷与肿瘤组织样本高度一致。值得注意的是，即使在细胞学检查肿瘤细胞阴性的MPE中，上清液仍能有效检测到基因变异，这一结果与既往Song等报道一致，该研究进一步对10例MPE上清检出靶向变异并接受相应治疗的患者进行随访，结果全部达到部分缓解（partialresponse）或者疾病稳定（stabledisease）。一项来自中国台湾的前瞻性研究对39例Ⅳ期肺腺癌患者进行分析，结果显示MPE上清cfDNA的驱动突变检出率明显优于肿瘤组织和细胞沉淀样本。Mahmood等的研究也得到类似结论：MPE上清cfDNA检测驱动基因突变的阳性率高于细胞沉淀和血浆，且仅需少量MPE上清（如5mL）即可满足NGS检测需求。此外，MPE上清有时还能检出原发肿瘤组织中未被捕获的独特可靶向变异。在Tu等研究中，11例患者仅在MPE上清cfDNA中检出可靶向突变，其中4例接受相应靶向治疗后均出现临床响应，提示仅基于MPE上清的检测结果同样具备指导治疗的价值。综上所述，晚期NSCLC常伴发MPE，对于组织样本无法获取或质控不合格的初治患者，以及靶向治疗耐药后需再次进行分子检测的患者，建议采集MPE作为替代样本。在临床实践中，NSCLC患者通常还需结合PD-L1、ALK等蛋白表达水平以辅助制定临床治疗方案。MPE离心后的细胞沉淀可经石蜡包埋制成细胞蜡块，用于免疫组织化学检测。对于尚未完成分子检测的NSCLC患者，若细胞沉淀中肿瘤细胞含量充足（如肿瘤细胞占比≥10%），建议基于同一样本同步开展分子检测与免疫组织化学检测，以提高样本利用效率。推荐意见4：胸膜侵犯且有胸腔积液的NSCLC患者，当组织样本无法满足分子检测时，推荐胸腔积液细胞沉淀样本或上清cfDNA检测作为组织检测的替代方案（2A类）。脑脊液：脑脊液是充盈于脑室系统、蛛网膜下隙及脊髓中央管内的无色透明体液，其成分与压力在生理状态下通过多种调节机制维持相对稳定。然而，在疾病状态下，脑脊液的成分和压力可能发生改变，因此脑脊液分析已成为中枢神经系统疾病诊断和评估治疗反应的重要手段。脑脊液遍布中枢神经系统并与颅内病灶直接接触，使其在原发或转移性脑肿瘤的临床评估中具有重要价值。此外，脑肿瘤患者脑脊液中的cfDNA浓度通常高于外周血，能更准确地反映颅内肿瘤的突变负荷和基因组特征。因此，在无法获取组织样本的脑肿瘤患者中，脑脊液cfDNA分子检测已成为重要的替代方案。脑脊液经离心后可分离为上清液与细胞沉淀，脑脊液上清中的cfDNA在检测肿瘤相关基因突变方面具有显著优势。Fang等对125例伴脑膜转移的NSCLC患者进行NGS检测，发现基线脑脊液上清cfDNA的突变检出率达99.2%，远高于血浆样本的57.6%；其中，具有明确临床意义的Tier1突变检出率在脑脊液上清中为86.3%，亦显著高于血浆的39.2%。一项纳入72例脑膜转移NSCLC患者的研究进一步证实，脑脊液上清的基因突变检出率优于血浆。一项针对970例伴中枢神经系统转移的NSCLC患者的真实世界研究也证实脑脊液上清的检测阳性率高于血浆，该结论在其他多项研究中也得到一致验证。对于原发性中枢神经系统肿瘤，除细胞学检测外，基于脑脊液上清cfDNA的基因检测也已有较多研究报道。一项前瞻性研究对32例脑胶质瘤患者的脑脊液进行分析，发现脑脊液上清cfDNA中至少一种致病性基因变异的检出率为59%，与组织检测结果的一致性为84%，而血浆cfDNA变异的检出率仅为14%。另一项研究纳入15例患有不同类型原发性中枢神经系统肿瘤的儿童患者（包括髓母细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样瘤等），共收集17份脑脊液上清样本进行NGS检测。结果显示，所有检出的体细胞突变和拷贝数变异（copynumbervariation，CNV）均与配对的肿瘤组织结果一致，而对应的血浆样本中未检出肿瘤来源cfDNA。值得注意的是，即使在细胞学检测阴性的脑脊液样本中，仅需200μL脑脊液上清亦可检测到肿瘤相关的cfDNA变异。综上所述，对于伴有中枢神经系统转移的NSCLC患者，以及原发性中枢神经系统肿瘤患者，可考虑采集脑脊液进行分子检测。新近研究数据显示，脑脊液上清cfDNA不仅与组织检测结果高度一致，其检出率也优于血浆和脑脊液细胞沉淀。因此，建议优先选择脑脊液上清进行cfDNA分析。对于其他类型实体瘤中枢神经系统转移患者，可在充分评估临床获益与操作可行性的基础上，开展脑脊液上清cfDNA检测。推荐意见5：脑转移NSCLC患者或原发中枢神经系统肿瘤患者，可选择脑脊液上清进行cfDNA检测（2A类）。4.腹腔积液/腹腔灌洗液：腹腔积液常见于原发性腹膜肿瘤以及伴腹膜转移的结直肠癌、卵巢癌、胃癌等肿瘤，其液体中通常富含肿瘤细胞释放的cfDNA。一项对比结直肠癌患者腹腔积液和外周血cfDNA检测的研究显示腹腔积液cfDNA的突变检出率远高于血浆，且中位突变等位基因频率也显著更高。Yuan等在40例转移性结直肠癌患者的队列中（包括17例腹膜转移和23例非腹膜转移），采用超深度NGS技术对比肿瘤组织DNA与腹腔灌洗液cfDNA的突变谱，结果显示腹腔灌洗液cfDNA与组织样本的总体突变一致性为56%，而在驱动基因突变层面一致性提升至83%。此外，一项晚期卵巢癌研究发现，腹腔积液cfDNA检测的灵敏度为97%，特异度为83%，与组织检出的一致性高达95%。该研究纳入的18例患者的腹腔积液cfDNA均完成了同源重组修复缺陷分析，其中包括4例组织样本分析失败的患者。另一项卵巢癌的研究也发现，基于腹腔积液cfDNA的基因突变与同源重组修复缺陷检测均具有较高阳性率，且与组织同源重组修复缺陷结果高度一致，进一步支持了腹腔积液cfDNA检测的可靠性。推荐意见6：对于原发性腹膜癌、结直肠癌以及卵巢癌，在组织检测不可及时，可选择腹腔积液/腹腔灌洗液上清cfDNA检测作为替代方案（2B类）。5.尿液：尿液是除血液外另一种能够汇集全身代谢产物及组织相关物质的重要样本，尿脱落细胞学检测也是目前泌尿系统肿瘤诊断的常用方法。根据来源不同，尿液中的肿瘤DNA可分为两类：一类源自非泌尿系统肿瘤，由肿瘤细胞裂解释放进入血液，再经肾小球滤过进入尿液，此类DNA浓度较低、片段较小；另一类直接来自泌尿系统肿瘤，不经过血液过滤，因此浓度更高、片段更长，更适合用于基因检测。尿液样本在泌尿系统肿瘤中表现出优异的检测性能。Hirotsu等在25例早期尿路上皮癌患者中比较了组织、尿液（上清/沉淀）和血液样本的突变检测效果，结果显示以组织检测到的168个突变为基准，尿液上清和沉淀的突变检出一致性分别为53%（89/168）和48%（81/168），显著高于血浆样本的2%（3/168）。另一项来自中国的研究纳入了59例尿路上皮癌患者，采用NGS同步检测组织DNA、血浆cfDNA和尿液cfDNA，发现尿液cfDNA与组织的一致性优于血浆。在前列腺癌中，Chen等的研究也表明尿液cfDNA相比血浆cfDNA具有更高的突变检出率。除泌尿系统肿瘤外，尿液样本在NSCLC、乳腺癌、结直肠癌等其他瘤种中也被证实可用于用药指导或疗效监测。综上所述，尿液可作为尿路上皮癌患者组织不可及时的有效替代样本；对于其他癌种，也可根据临床实际情况考虑使用。推荐意见7：对于尿路上皮癌以及前列腺癌，在组织检测不可及时，可选择尿液cfDNA检测作为替代方案（2B类）。6.其他体液标本：（1）支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolarlavagefluid，BALF）/支气管灌洗液（bronchiallavagefluid，BLF）：BALF是通过纤维支气管镜，将无菌生理盐水灌注至支气管以下肺段或亚肺段水平后回收的肺泡表面衬液。而BLF则主要来源于气管或主支气管水平的灌洗回收液。通过检测BALF或BLF可获取细胞学、可溶性蛋白、酶类、细胞因子等多种生物信息，因此已成为诊断肺癌、间质性肺病和肺部感染等肺部疾病的重要手段。基于BALFcfDNA的分子检测研究显示，其突变检出灵敏度介于65%~95%，显著优于细胞沉淀DNA检测。在一项纳入34例Ⅰ~Ⅳ期肺癌的对比研究中，以组织检测为对照，BALFcfDNA的突变阳性率显著高于血浆（81%vs.47%），尤其对血浆易漏检的Ⅰ~Ⅱ期早期肺癌患者，其灵敏度优势更为突出（77%vs.45%）。与此同时，针对BLF的相关研究也证实了其在上清检测中的独特价值。基于PCR技术进行EGFR单基因突变检测研究表明，BLF上清cfDNA的突变检出率显著高于血浆样本。此外，采用NGS进行多基因检测的研究也进一步证实，BLF上清cfDNA的基因突变检出率同样优于血浆。（2）痰液：痰液细胞学检查是肺癌早期诊断的重要手段之一，尤其适用于中央型肺癌。除细胞形态学观察外，痰液上清液也可用于分子检测。Wang等对83例肺腺癌患者的痰液样本进行NGS检测，结果显示痰液样本的突变阳性率为65.1%，与组织检测结果相比，灵敏度为81.3%，特异度达100%。Xie等研究纳入71例Ⅲ~Ⅳ期NSCLC患者，对比痰液上清、血浆和组织样本的测序结果，发现组织样本的总突变检出率为95.8%，痰液为67.6%，血浆为70.4%。进一步亚组分析显示，在中央型肺癌和肺鳞癌患者中，痰液的突变检出率高于血浆。（3）胆汁：胆汁是由肝细胞分泌的重要消化液，经肝内胆管、肝总管和胆囊管输送并贮存于胆囊。近年研究表明，基于胆汁cfDNA的检测可作为胆道肿瘤辅助诊断的重要手段之一，其cfDNA浓度通常显著高于血浆。Gou等对28例Ⅰ~Ⅳ期胆道肿瘤患者测序分析显示，胆汁基因突变检出率为71.4%，明显高于血浆的53.6%；Ito等在24例胆道肿瘤患者中的研究发现，胆汁与血浆cfDNA中驱动基因突变的检出率分别为54%和17%。一项纳入87例患者（59例胆管癌、12例胆囊癌、16例胰腺癌）的对比研究进一步显示，胆汁检测致癌突变的灵敏度为56%，优于血浆的24%，且胆汁中的变异丰度更高。值得注意的是，该研究还发现血浆的检出率随疾病分期升高而增加，而胆汁样本的检测性能在不同分期中保持稳定。Kinugasa等通过对比24例胆囊癌患者的肿瘤组织与胆汁cfDNA测序结果，发现87.5%的患者胆汁与组织基因变异一致，进一步验证了胆汁样本在分子分型中的可靠性。推荐意见8：对于其他体液如BALF、痰液、胆汁等，在组织不可及的情况下，可结合临床实际情况选择合适的标本进行cfDNA检测（2B类）。三、体液样本的采集、预处理及储存由于体液中存在背景核酸干扰，且肿瘤来源的DNA丰度通常较低，因此对样本处理及整个检测流程的规范性要求非常严格。尤其在标本预处理环节，必须最大限度地降低背景核酸对肿瘤DNA的稀释效应，并防止cfDNA发生降解，以降低假阴性结果的风险。以下是常见体液标本的采集与预处理规范流程。1.血浆：建议在患者安静状态下采集外周静脉血样本，无需禁食。cfDNA检测推荐使用专门的游离DNA采血管（含特殊抗凝剂与核酸保护剂，如Streck采血管）或EDTA抗凝采血管采集10mL全血，抽血后立即轻柔颠倒采血管10次，以充分混匀管内试剂与血液，尽量避免溶血或凝血。采集完成后常温转运至检测实验室，在7d内完成两步离心法分离血浆（若使用普通EDTA抗凝采血管，须在采血后2h内完成血浆分离）。两步离心法：在4℃条件下，先以1600×

g离心10min，取上清（注意不要吸到白膜层，以防基因组DNA的干扰），再16000×

g离心10min，取上清，获得无细胞血浆。分离后的血浆可直接进行DNA抽提，或储存于-80℃冰箱中待用。对于血液样本采集，建议尽量避免在接受放疗或化疗后立即进行抽血检测。此时白细胞DNA可能大量释放，稀释本就含量较低的肿瘤来源DNA，从而增加检测假阴性的风险。建议上一个治疗周期结束后2~3周采血。对于输血的患者，通常建议输血后2周采血，以免对结果准确性造成干扰。此外，在采血过程中需尽量避免发生溶血。如采血时压脉带绑扎时间过长、采血速度过快，或采血后用力摇晃采血管等，均可能导致溶血。溶血常伴随白细胞破裂并释放大量基因组DNA，从而稀释肿瘤DNA浓度，增加假阴性的风险。因此，对于出现明显溶血的样本（如肉眼观察血浆呈红色），建议重新采集样本，以确保检测质量和结果的可靠性。2.胸腔积液/腹腔积液：通过胸膜腔或腹膜腔穿刺采集8~10mL样本，置于游离DNA保存管中，采集后常温转运至检测实验室，在7d内完成两步离心（方法同血浆）；如置于普通的收集管中，应在离体后2h内分离。分离所得上清可用于DNA抽提或冷冻保存（-80℃）。3.脑脊液：通过腰椎穿刺获取脑脊液，必要时可采用小脑延髓池或侧脑室穿刺方式。采集8~10mL样本置于游离DNA保存管中，采集后常温转运至检测实验室，在7d内完成两步离心（方法同血浆）；如置于普通的收集管中，应在离体后2h内分离。分离所得上清可用于DNA抽提或冷冻保存（-80℃）。4.肺泡灌洗液：使用支气管镜向支气管肺泡注入生理盐水并立即抽吸，收集8~10mL样本，置于游离DNA保存管中，采集后常温保存并及时送检，在7d内完成两步离心（方法同血浆）；如置于普通的收集管中，应在离体后2h内分离。分离所得上清可用于DNA抽提或冷冻保存（-80℃）。5.尿液：收集患者随机中段尿10~40mL，置于游离DNA保存管中，采集后常温保存并及时送检，在7d内完成两步离心（方法同血浆）；如置于普通的收集管中，应在离体后2h内分离。分离所得上清可用于DNA抽提或冷冻保存（-80℃）。6.痰液：患者在采集前1h内应避免进食、饮水、吸烟及口腔清洁操作。按照诱导痰采集方法，促使患者产生痰液并咳出，收集2mL以上诱导痰（浮在诱导痰上层的少量泡沫不计入收集量）于痰液样本专用收集管。收集后应立即旋紧管盖，并上下轻柔颠倒5~10次，使痰液与细胞保存液充分混合。并于72h内运送至实验室（6~30℃条件），参考血浆样本处理的两步离心法分离上清，分离所得上清可用于DNA抽提或冷冻保存（-80℃）。推荐意见9：利用体液cfDNA进行NGS检测时，应严格按照规范的流程进行样本的采集和处理，防止cfDNA发生降解（1类）。四、体液cfDNA的NGS检测及质量控制1.体液cfDNA的提取：cfDNA提取效率是影响NGS检测结果的关键因素之一。目前常用的提取方法主要包括亲和柱法和磁珠法。提取后需对cfDNA进行质量评估，主要包括核酸浓度、总量、片段长度和完整性。cfDNA浓度低会导致总量不足，而核酸投入量与检测灵敏度直接相关，一般建议用于NGS建库的cfDNA总量不少于30ng，具体需结合检测平台和试剂要求确定。在片段长度分析方面，高质量的血浆cfDNA通常以约160~180bp为主峰。若样本中出现较多>1000bp的大片段DNA，提示可能存在基因组DNA污染，常与样本处理延迟、离心不及时或白细胞裂解有关；若片段明显偏短或呈弥散分布，则可能提示DNA降解或保存不当。经质量评估合格的样本方可进入后续NGS检测流程。如暂不检测，cfDNA应置于-20℃条件下短期保存；长期保存建议置于-80℃条件下，并尽量避免反复冻融，以确保样本稳定性和检测结果的准确性。2.体液cfDNANGS检测文库构建策略：基于NGS的cfDNA靶向测序，文库构建主要包括杂交捕获法与扩增子法两种策略，各有技术特点与适用场景。杂交捕获法通过DNA或RNA探针与目标区域杂交富集后进行测序，能够覆盖较大基因区域，检测多种变异类型，包括单核苷酸变异、小片段插入缺失、拷贝数变异及DNA层面的基因重排，检测灵敏度通常可达较高水平。该方法文库复杂度高、扩增偏好性低，适用于低频突变检测及多基因综合分析，且便于后续数据重分析，但操作步骤相对较多，建库周期一般为1~2d。扩增子法则通过多重PCR特异性扩增目标区域进行富集，具有操作流程相对简便、建库时间较短、对初始DNA投入量要求较低等优势，适用于已知热点位点的快速检测。然而，由于依赖PCR扩增，可能存在扩增偏好性，对GC富集区或复杂结构区扩增效率较低，检测基因覆盖范围相对有限，对大片段缺失及部分结构变异的检测能力亦存在一定局限。鉴于cfDNA样本中肿瘤DNA含量通常较低且呈高度片段化特征，杂交捕获法在低频突变识别、基因覆盖广度及未知变异检测方面更具优势，更符合临床对全面、准确检测的需求；而扩增子法在特定位点快速检测或样本量极低情况下亦具有一定应用价值。无论采用何种建库策略，均应建立明确的文库质量控制标准。建库完成后，在上机测序前需进行文库质量评估，包括片段分布是否相对集中、是否存在游离接头或接头二聚体、文库片段大小是否符合推荐范围等，确保文库质量达标后方可进入测序流程，以保障检测结果的准确性与稳定性。3.体液cfDNANGS检测的生信质控：质量控制直接影响检测结果的准确性与可靠性，因此建立完善的质控体系至关重要。体液cfDNA检测应建立覆盖测序深度、数据质量、序列比对及靶向富集等关键环节的生物信息学质控体系（表3）。平均有效测序深度是保障低频变异检出能力的核心指标。由于体液cfDNA中肿瘤来源DNA含量通常较低，充分的测序深度对于从大量正常cfDNA背景中识别低频变异至关重要。血浆cfDNA检测建议平均有效测序深度达到1000×以上，胸腹水、脑脊液等其他体液标本建议达到500×以上。碱基质量Q30反映测序原始数据质量，是评估数据可靠性的基础指标；序列比对率、在靶率及覆盖均一性分别用于评价序列比对效率、靶向富集特异度及目标区域覆盖均衡性，各项指标均应达到预设质控标准或经实验室性能验证确认的分析要求。仅当各项质控指标均符合要求时，方可进入后续变异分析与结果判读流程，以确保检测结果的准确性和可重复性。4.体液cfDNANGS检测准确性提升策略：相较于肿瘤组织检测，体液cfDNA的NGS检测在技术与分析层面面临更大挑战。其主要难点在于体液cfDNA（尤其对于血浆）主要来自正常细胞，肿瘤来源DNA比例极低，导致肿瘤特异性体细胞突变的等位基因频率通常极低。为了保证检测灵敏度，需采用远高于组织检测的测序深度。然而，高深度测序在提升灵敏度的同时，也会放大cfDNA检测中固有的背景噪音，包括较高比例的PCR重复序列（通常可达50%~90%）、PCR扩增错误以及测序平台自身引入的随机错误。这些因素显著增加了假阳性变异检出的风险，亟须通过优化生物信息学分析流程和误差校正策略，有效区分真实低频体细胞突变与随机测序误差。另外对于CNV而言，体液样本中低肿瘤DNA含量情况下难以准确区分肿瘤相关基因扩增与正常拷贝数波动，从而限制了CNV检测的灵敏度与定量准确性。基因融合变异同样高度依赖肿瘤DNA含量，在循环肿瘤DNA水平较低时容易发生遗漏检出，因此在结果解读和报告时需特别关注此类结构变异的潜在假阴性风险。此外，体液样本中白细胞来源的克隆性造血相关突变可能干扰肿瘤体细胞突变的准确鉴定。为降低此类假阳性信号的影响，建议通过同步检测配对的外周血白细胞样本，或结合成熟的克隆性造血突变背景数据库，对相关变异进行系统性识别与去除，从而进一步提升cfDNANGS检测结果的准确性与可靠性。5.开展体液cfDNANGS检测前应完成充分的性能评估：针对体液cfDNA的NGS检测，应优先选择经国家药品监督管理局（NationalMedicalProductsAdministration，NMPA）批准的商品化试剂盒进行检测。当无获批试剂盒可用时，实验室自建检测可作为备选的解决方案。与获批的体外诊断试剂开展的性能验证不同，针对实验室自建检测需要在正式开展前完成检测流程确认，明确质控标准，建立标准作业程序，并且在仪器或关键试剂更换、检测样品类型变化时重新进行性能确认。性能确认应制定完整的方案，包括样本类型和数量、阳性符合率和阴性符合率、基因变异检测的重现性和重复性、检测限、干扰物质、生物信息分析流程的性能确认和其他参数等。推荐意见10：由于体液cfDNA中肿瘤源性DNA含量通常较低，与组织样本相比，建议适当提高测序深度并优化生物信息学分析流程，以提升检测的灵敏度与特异度（1类）。推荐意见11：体液cfDNA的NGS检测应优先选用经国家药品监督管理局（NMPA）批准的商品化试剂盒，在应用于临床检测前，须完成性能验证；在尚无获批试剂盒的情况下，基于实验室自建的NGS检测可作为备选方案，临床应用前须完成严格的性能确认（1类）。五、体液cfDNANGS检测报告规范与报告解读