无菌检查医学知识专题讲座

无菌检验陈晨

.07.02无菌检查医学知识专题讲座1/19一、无菌检验环境确保培养基确保有效方法SOP操作有效结果无菌性检验灵敏度检验方法确认可靠结论结果判断无菌检查医学知识专题讲座2/19二、检测标准《中华人民共和国药典》版

四部1101无菌检验法GB/T14233.2-医用输液、输血、注射器具检验方法

第2部分:生物学试验方法ISO11737-2医疗设备灭菌－微生物学方法

第二部分:灭菌过程中无菌测试定义，验证及维护无菌检查医学知识专题讲座3/19三、检测环境版药典要求1101无菌检验:无菌检验应在无菌条件下进行，试验环境必须到达无菌检验要求。9203药品微生物试验室质量管理指导标准:无菌检査应在B级背景下A级单向流洁净区域或隔离系统中进行，单向流空气

、工作台面及环境应定时按医药工业洁净室（区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法现行国家标准进行洁净度确认。隔离系统应定时按相关要求进行验证，其内部环境洁净度须符合无菌检验要求。

GB/T14233.2-:无菌室操作台或超净工作台局部应符合洁净度100级单向流空气区域要求。

无菌检查医学知识专题讲座4/19四、菌种选择菌株名称及编号菌种分类无菌检验适用性培养基查适用性金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003革兰氏阳性菌✔✔大肠埃希菌CMCC(B)44102革兰氏阴性菌、对抑菌性敏感✔×铜绿假单胞菌CMCC(B)10104革兰氏阴性菌、对营养物质要求高×✔生孢梭菌CMCC(B)64941厌氧菌✔✔枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501芽孢杆菌✔✔白色念珠菌CMCC(F)98001酵母菌✔✔黑曲霉CMCC(F)98003霉菌✔✔注:菌株传代次数不得超出5次。

无菌检查医学知识专题讲座5/19五、试验材料准备1.试验所需培养基及稀释液（版药典）①胰酪大豆胨液体培养基——用于真菌和需氧菌培养②流乙醇酸盐流体培养基——用于厌氧菌培养，也可用于需氧菌培养。③胰酪大豆胨琼脂培养基——用于细菌计数④沙氏葡萄糖琼脂培养基——用于霉菌计数无菌检查医学知识专题讲座6/19五、试验材料准备2.培养基配制①直接购置配制好干粉培养基，按照培养基包装上说明，取要求量干粉培养基及纯化水进行配制，按121℃，15min进行灭菌，灭菌后冷却至室温备用。②药典要求：配制好培养基应保留在2~25℃，非密闭容器，普通三周以内使用。

无菌检查医学知识专题讲座7/19五、试验材料准备3.培养基适用性检验①无菌性检验——排出培养基本身污染，防止无菌试验过程中由培养基引发假阳性②灵敏度检验——确保培养基营养性良好，对微生物含有生长促进作用，排出无菌试验过程中由培养基引发假阴性注：用于无菌检验培养基必须经过培养基适用性检验。无菌检查医学知识专题讲座8/19五、试验材料准备3.培养基适用性检验培养基菌株数量菌量培养FTM(12ml)金葡2＜100cfu/ml30~35℃

3天铜绿2生孢2阴性1/无菌性5/30~35℃

14天TSB（9ml）枯草2＜100cfu/ml20~25℃

5天白念2黑曲霉2阴性1/无菌性5/20~25℃

14天无菌检查医学知识专题讲座9/19五、试验材料准备4.其它试验材料①带滤芯枪头②量筒（100ml）③剪刀、镊子④无尘布以上物品可采样湿热灭菌121℃，30min。

无菌检查医学知识专题讲座10/19六、试验设备1、电子天平——用于培养基干粉称量2、压力蒸汽灭菌器——用以培养基及试验物品灭菌3、生化培养箱——用于细菌培养4、霉菌培养箱——用于霉菌及酵母菌培养5.生物安全柜——用于试验环境提供无菌检查医学知识专题讲座11/19七、菌液制备菌株准备：取1瓶复溶液和1瓶定量菌株，平衡至室温。在生物安全柜内，撕开菌株瓶铝塑组合盖，在无菌操作下，取镊子过火焰灭菌后，待其冷却，用镊子打开菌株瓶冻干塞，打开复溶液螺旋盖并把菌株冻干粉倒入复溶液中，重新旋紧螺旋盖并漩涡震荡最少10秒确保菌株完全溶解，即得所需菌悬液（每0.1mL菌悬液即含10~99cfu)。

无菌检查医学知识专题讲座12/19八、验证方法目标：确认无菌试验产品是否含有抑菌性;假如有，怎样去除，并被证实。无菌检验方法有直接培养法和薄膜过滤法两种。医疗器械最常使用方法为直接培养法，薄膜过滤法适合用于液体类产品或供试品已转化为供试液产品，本企业产品制备成供试液后仍有颗粒杂质无法过滤，故选取直接培养法。

无菌检查医学知识专题讲座13/19八、验证方法——直接培养法培养基菌株菌量供试品组别培养流乙醇酸盐流体培养基金葡＜100cfu/ml√试验组30~35℃

不得超出5天金葡——阳性对照组大肠√试验组大肠——阳性对照组生孢√试验组生孢——阳性对照组胰酪大豆胨液体培养基枯草√试验组20~25℃

不得超出5天枯草——阳性对照组白念√试验组白念——阳性对照组黑曲霉√试验组黑曲霉——阳性对照组无菌检查医学知识专题讲座14/19八、验证方法——薄膜过滤法供试品稀释、过滤菌株菌量培养基组别培养√金葡最终一次冲洗液加菌＜100cfu/ml流乙醇酸盐流体培养基试验组30~35℃

不得超出5天——金葡阳性对照组√大肠试验组——大肠阳性对照组√生孢试验组——生孢阳性对照组√枯草胰酪大豆胨液体培养基试验组20~25℃

不得超出5天——枯草阳性对照组√白念试验组——白念阳性对照组√黑曲霉试验组——黑曲霉阳性对照组无菌检查医学知识专题讲座15/19八、验证方法——结果判断与对照管比较,如含供试品各容器中试验菌均生长良好,则说明供试品该检验量在该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用能够忽略不计,照此检验方法和检验条件进行供试品无菌检査。如含供试品任一容器中试验菌生长微弱、迟缓或不生长,则说明供试品该检验量在该检验条件下有抑菌作用,应消除供试品抑菌作用,并重新进行方法适用性试验。

无菌检查医学知识专题讲座16/19九、产品有抑菌性办法1、增加冲洗量2、增加培养基用量

✔3、使用中和剂或灭菌剂4.更换滤膜品种注：消除供试品抑菌作用，并重新进行方法适用性试验日常无菌检验阳性对照菌选择：无抑菌作用及抗革兰氏阳性菌为主供试品，选择金黄色葡萄球菌为对照菌。无菌检查医学知识专题讲座17/19十、日常无菌检验无菌检验室供试品接入培养基FTM+供:2管TSB+供:1管阴性:各1管（FTM、TSB)准备间培养基、供试品、灭菌物品准备阳性对照室取其中一管FTM+供,加入1~100cfu金黄色