CN119504978A 重组人源化iii型胶原蛋白f3的制备方法和用途 （武汉佳惟达生物科技有限公司）

重组人源化III型胶原蛋白F3的制备方法和本发明提供了重组人源化III型胶原蛋白F3肽包含n个与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有2或者所述胶原蛋白包含n个与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸2.如权利要求1所述的胶原蛋白，其特征在于，所(B)具有与SEQIDNO.4或8所示的氨基酸序列≥80％同源性(优选地，≥90％的同源在权利要求1所述的胶原蛋白或权利要求8所述的组合物存在下3[0002]胶原蛋白是一类生物高分子蛋白的总称，不仅是动物结物源病毒感染风险。第二种采用基因工程技术通过生物发酵法表达并纯化的重组胶原蛋功能的序列片段是影响胶原蛋白基础研究和产业化4[0007]鉴于上述现有技术的不足之处，申请人利用生物信息学分析III型胶原蛋白成熟发明的重组人源化III型胶原蛋白具有明显的促进细胞[0028](b)所述核苷酸序列与SEQIDNO.5序列中任一所示的核苷酸序列有≥95％的同56[0057]向有所需要的对象施用有效量的本发明第一方面所述的胶原蛋白或本发明第六[0075]本申请中的序列同一性是指通过本领域中已知的算法，包括但不限于blast、7[0077]本申请中与SEQIDNO.1所示的氨基酸序列有95％以上同一性的氨基酸序列与[0078]胶原蛋白肽的编码序列本领域技术人员可以使用现有的氨基酸编码规则知识和[0081]本申请制备方法中表达菌株转化以及培养和表达步骤的常规策略和工具本领域[0082]本申请中的表达载体可选用各种市售/记载/研究中的载体，包括但不限于Pllp、[0083]本申请中的标签去除用蛋白酶的识别基序包括但不限于TEV蛋白酶、Thrombin、8明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或几个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多物属于本领域熟练技术人员公知的范围。9从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。[0109]本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50较佳地至少70更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件(或严紧条件)下与[0111]本发明多核苷酸全长序列通常可以通过PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/R蛋白肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术产生本发明所述多肽的方[0118]通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核苷酸序列可用来表达或生产重[0123]本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明胶原蛋白肽编码DNA序列和合[0125]包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的[0129]用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原[0135](3)本发明利用生物信息学分析III型胶原蛋白成熟区段存在的胶原蛋白功能结件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(NewYork:ColdSpringHarbor[0138]人III型胶原蛋白α1链氨基酸序列来源于美国国立生物技术信息进一步采用SMART(https://smart.embl.de/)和CD_search(httpsGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGEN(SEQIDNO.1)命名为F3，将168位至233位之间的胶原蛋白功能结构域序列：GLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPP[0141]ENLYFQGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGEN*(SEQIDNO.4)[0142]GRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKGENGLPGENGRPGERGLPGPPGIKGPAGIPGFPGMKGHRGFDGRNGEKGETGAPGLKG[0143]根据中心法则对F3序列重复8次的氨基酸序列进行反翻译，获得编码的核糖核酸现100％人源化，在F12重复7次序列的N端添加TEV蛋白酶识别剪切基序ENLYFQ(SEQIDQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDGESGLAGYPGPAGPPGPPGPPGTSGHPGSPGSPGYQGPPGEPGQAGPSGPPGPPGAIGPSGPAGKDG[0150]表达菌株的转化：将p32F3和p32F12表达质粒分别转化至大肠杆菌感受态细胞于‑20℃或立即进入裂解纯化流程。后经12000rpm、10min离心，取5μL上清液加入SDS‑PAGE蛋白胶孔中(金斯瑞生物，货号：[0156]反复冻融样品来源于实施例2离心后的菌体裂解液上清，取40μL分装至若干个EP无降解。综合不同温度处理实验和反复冻融实验的结果，表明p32F3蛋白具有很强的稳定根据A215吸收值收集洗脱峰；最后以25mL的再生缓冲液(20mMPB缓冲液，500mM氯化钠，约为50EU/mL，于16℃条件下孵育4h后，再次经上述NiFocuroseFF(IMAC)预装柱层析分离。将上述再生后的层析柱