CN119506113A 犬血清白蛋白重组蛋白及其在汉逊酵母中的表达方法 （中国科学院天津工业生物技术研究所）

所犬血清白蛋白重组蛋白及其在汉逊酵母中本发明公开了一种构建高效生产犬血清白优化犬血清白蛋白在汉逊酵母中的拷贝数等方母菌株在发酵罐高密度发酵生产6天产量可达291至少92至少93至少94至少95至少96至少97至少98至少99%,或100%;所述的犬血清白蛋白是SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或与其具有85%以上同源性的氨基酸序列。照汉逊酵母的密码子使用频率进行密码子优化，具体地，优化后的核苷酸序列如SEQID至少91至少92至少93至少94至少95至少96至少97至少98至少pPIC9K将所述犬血清白蛋白表达元件整合到9.如权利要求7或8所述的表达方法，其3初始流加速率为10ml/h，每小时取样，蔗糖电极测定浓度(随溶氧变化调节蔗糖流加速4[0002]犬血清白蛋白(Canineserumalbumin，CSA)是由584个氨基酸组成的单链蛋白[0003]2000年发表的文章Escherichiacoliexpressionandpurificationofrecombinantdogalbumin,across一reactiveanimalallergen公开了在大肠杆菌中表[0004]比较近几十年关于犬血清白蛋白异源表达研究进展和日益增长的犬血清白蛋白[0005]本发明要解决的技术问题在于提供一种在汉逊酵母菌株中表达犬血清白蛋白的[0006]本发明提供一种表达犬血清白蛋白或包含犬血清白蛋白的融合蛋白的重组汉逊5少91至少92至少93至少94至少95至少96至少97至少98至少99或100％。[0009]所述的犬血清白蛋白是SEQIDNo.1所示的氨基酸序列或与其具有85％以上同源性的氨基酸序列。No.2所示核苷酸序列具有至少85例如，至少85至少90至少91至少92至少93至少94至少95至少96至少97至少98至少99或至少100％序列同一性的核苷酸序列。4Na2MoO42O46[0023]汉逊酵母中不同启动子的犬血清白蛋白重组菌表达量差异显著：蔗糖诱导型PMAL启动子和组成型PGAP启动子的重组汉逊酵母，其白蛋白的表达量明显高于含有组成型PPMA1[0024]针对不同拷贝数和启动子组合的优化发现：PGAP启动子的多拷贝重组菌表达量优于单拷贝数的表达量，但其两拷贝数的表达量与单拷贝PMAL启动子的重组菌表达量基本相MAL启动子的多拷贝重组菌表达量明显优于单拷贝数的表达量，但拷贝数在2个以上后拷贝数的PMAL启动子重组菌，但是蔗糖诱导型启动子PMAL与组成型启动子PGAP组合的三拷贝导型启动子PMAL的重组犬血清白蛋白酵母2。7频率最高或较高的密码子；b)避免对基因转录或蛋白翻译有潜在影响的负调控元件，如酵母质粒pGAPzαA(购自Invitrogen公司)为模板，设计载体骨架引物BB_F:CSA。将上述扩增获得的四个片段按照1:1:1:1的比例混合后，加入10μl无缝克隆酶(购自[0037]在上述构建获得的载体pWSJ01_PGAP_CSA_TAOX1基础上，进一步更换不同类型的启测序，将测序正确的载体分别命名为：pWSJ02_PMAL_CSA_TAOX1、pWSJ03_PPMA1_CSA_TAOX1、8用等体积酚:氯仿(1:1,v/v)抽提一次，再用乙醇沉淀回收DNA。_20℃沉淀2h以上后，9酵母细胞涂布于0.4mg/mlG418的YPD平板中；转入质粒pWSJ02_PMAL_CSA_TAOX1、pWSJ04_[0049]将传至10次的重组汉逊酵母表达菌株接入5ml不含Zeocin抗性的YPD液体培养基[0051]挑取组成型表达的重组汉逊酵母S_Pma1_CSA、S_Gap_CSA单菌落，接种入含5ml在汉逊酵母基因组上的拷贝数和不同强度启动子之间的组合使用进行优化。根据实施例4中不同启动子的血清白蛋白表达量的结果,针对犬血清白蛋白的表达进行如下步骤的优[0057]使用限制性内切酶Bgl聂单酶切实施例2中构建完成的质粒载体pWSJ01_PGAP_CSA_TAOX1血清白蛋白表达元件(包括启动子GAP_信号肽_白蛋白[0060]使用限制性内切酶Bgl聂单酶切载体pWSJ05_(PGAP_CSA_TAOX1)2，表蛋白表达元件，无缝克隆酶连接并验证，将测序正确的载体命名为：pWSJ08_(PMAL_CSA_白蛋白表达元件F_PMAL_CSA；将扩增获得的目的片段无缝克隆的构建方法插入到酶切后的增犬白蛋白表达元件，将扩增获得的目的片段无缝克隆的构建方法插入到酶切后的载体MAL_CSA_TAOX1)2_PGAP_CSA_TAOX1。[0065]将上述构建完成的载pWSJ05_(PGAP_CSA_TAOX1)2、pWSJ06_(PMAL_CSA_TAOX1)2、pWSJ07_(PGAP_CSA_TAOX1)3、pWSJ08_(PMAL_CSA_TAOX1)3、pWSJ09_PMAL_CSA_TAOX1_(PGAP_CSA_TAOX1)2、pWSJ010_(PMAL_CSA_TAOX1)2_PGAP_CSA_TAOX1按例3中的培养条件将以上多拷贝的菌株和单拷贝的菌株进行摇瓶发酵，SDS_PAGE电泳图显动子重组菌表达量与2个拷贝重组菌相近。而组合启动子重组菌S_(Mal_CSA)2_Gap_CSA在[0071]发酵工艺：发酵起始培养基含有酵母粉100g，蛋白胨50g，甘油200g，基础盐4Na2MoO42O4