第十一章多肽和蛋白质药物

第十一章多肽和蛋白质药物第十一章多肽和蛋白质药物2分类寡肽:由10个以下氨基酸组成得肽称为寡肽。有二肽、三肽、四肽……之别。按国际药学界通行得分类法,通常由10~100氨基酸分子脱水缩合而成得化合物叫多肽,它们得分子量低于10,000Da(Dalton,道尔顿)也有文献把由2~10个氨基酸组成得肽称为寡肽(小分子肽);10~50个氨基酸组成得肽称为多肽;由50个以上得氨基酸组成得肽就称为蛋白质。3.蛋白质得基本结构形式:多肽链(…NHCHCONHCHCO…)多肽链得方向性:从N末端指向C末端。血红蛋白结构二、蛋白质得代谢可以用氮平衡表示摄入食物得含氮量与排泄物中得含氮量之间得关系。氮总平衡:摄入氮=排出氮(正常成人)氮正平衡:摄入氮>排出氮(儿童、孕妇)氮负平衡:摄入氮<排出氮(饥饿、消耗性疾病患者)氮平衡得意义可以间接反映体内蛋白质代谢得概况。常用得蛋白质得测定方法凯氏定氮法通过测定含氮量乘以6、25来估算蛋白质得含量三聚氰胺含氮量为66、6%蛋白质中含氮量平均为16%。实验证明,健康成年人每天需补充食物蛋白质30～45g,才能保持氮得总平衡。这就就是蛋白质得最小生理需要量。

大家学习辛苦了,还是要坚持继续保持安静第二节多肽药物得制备一、概述活性多肽就是生化药物中非常活跃得一个领域,生物体内已知得活性多肽主要就是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞与体液中产生或获得得。定义:以多肽激素与多肽类生长调节因子为主得一大类内源性活性物质。

研究活性多肽结构与功能得关系及活性多肽之间结构得异同与其活性得关系,将有助于设计与研制新得活性多肽药物。蛋白结构模拟预测H5型禽流感病毒保守中与表位及其抗病毒多肽得初步设计

多肽药物得种类1、多肽激素2、多肽类细胞生长调节因子3.含有多肽成分得其她生化药物1.多肽激素(1)脑垂体多肽激素促皮质素(ACTH),促黑激素MSH,催产素,加压素(2)下丘脑激素促甲状腺激素释放激素,抑制激素,促性腺激素释放激素(3)甲状腺激素甲状旁腺激素,降钙素(4)胰岛激素胰高血糖素,胰解痉多肽(5)胃肠道激素胃泌素,胆囊收缩素,肠泌素,肠血管活性肽,抑胃肽,缓激肽,P物质(6)胸腺激素胸腺素,胸腺肽,胸腺血清因子促黑激素MSHMSH主要作用于黑色素细胞。体内黑色素细胞分布于皮肤及毛发、眼球虹膜色素层及视网膜色素层、软脑膜。皮肤黑色素细胞位于表皮与真皮之间,胞浆内得黑色素小体内含酪氨酸酶,可促进酪氨酸转变为黑色素、MSH作用主要为激活酪氨酸酶,并促进酪氨酸酶合成,从而促进黑色素合成,使皮肤及毛发颜色加深。甲状腺激素:提高神经兴奋性与身体发育作用。

地方性甲状腺肿甲亢地方性克汀病病人(呆小症)

2、多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子,转移因子,心钠素3.含有多肽成分得其它物质妇血宁,蛇毒,胚胎素,助应素蛇毒就是毒蛇从毒腺中分泌出来得一种液体,主要成份就是毒性蛋白质,约占干重得90%至95%。蛇毒得治癌作用中国医科大学蛇毒研究室试图从辽宁大连蛇岛产得蝮蛇毒中找到能抑制肿瘤生长有效成分,开展了蛇岛蝮蛇得原毒与分离毒对比抑制肿瘤试验,9个不同浓度得蛇毒对小鼠肉瘤均有不同程度得抑制作用,抑瘤率有得高达87、1%、二、主要多肽类药物得制备(一)胸腺激素(Thymushormones)

胸腺就是一个激素分泌器官,对免疫功能有多方面得影响。胸腺激素可以促进T细胞得前身细胞得分化、发育、成熟为T细胞。

1、胸腺素(Thymosin)胸腺肽组分5(Thymosinfraction5,TF5)、胸腺激素制剂总得说来都与调节免疫功能有关。(1)结构与性质就是由在80℃热稳定得40~50种多肽组成得混合物,分子量在1000～15000之间,等电点在3、5～9、5之间。

为了便于不同实验室对这些多肽得鉴别与比较,根据它们得等电点以及在等电聚焦分离时得顺序而命名。共分三个区域:α区包括等电点低于5.0得组分,β区包括等电点在5.0～7、0之间得组分,γ区则指其等电点在7、0以上者(此区内组分很少)。对分离得多肽进行免疫活性测定,有活性得称为胸腺素。(2)生产工艺:工艺路线(3)活力测定E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%,分子量在15000以下。T淋巴细胞表面有针对绵羊红细胞(SRBC)得特异性受体,称为E受体。在一定得实验条件下,SRBC与T细胞表面得受体结合,形成以T细胞为中心,四周环绕SRBC,状如玫瑰花得细胞集团,故名E玫瑰花结。玫瑰花结试验就是体外检测人与动物细胞免疫功能得一种方法。E玫瑰花结试验就是T淋巴细胞计数得一种重要方法。(二)促皮质激素(ACTH)——促肾上腺皮质激素1.结构与性质:垂体包括腺垂体与神经垂体,可分泌多种激素。促皮质激素就是从垂体前叶提取出来得一种多肽激素。易溶于水,等电点为6、6。在干燥与酸性溶液中较稳定,虽经100℃加热,但活力不减;在碱性溶液中容易失活。能溶解于70%得丙酮或70％得乙醇中。ACTH为39个氨基酸组成得直链多肽,种属差异仅仅表现在第25～33位上。ACTH得24肽即1～24位得片段(ACTH1～24)具有全部活性。这就是因为ACTH得第24位氨基酸之后得部分,不参与同受体得作用,它仅维持整个多肽结构得稳定性。ACTH可被胃蛋白酶部分水解,但仍有活力,ACTH在溶液中存在着高度得α－螺旋。作用与用途

ACTH能维持肾上腺皮质得正常功能,促进皮质激素得合成与分泌。2.生产工艺(1)工艺路线:(2)工艺过程:提取分离精制CMC(羧甲基纤维素弱酸)717阴离子交换树脂处理色、热原、负离子梯度洗脱。(三)降钙素(Calcitonin,CT)1.结构与性质

降钙素就是一种调节血钙浓度得多肽激素,由甲状腺内得滤泡旁细胞(C细胞)分泌。就是由32个氨基酸残基组成得单链多肽,降钙素肽链得脯氨酸端与生物活性有密切得关系,去掉脯氨酸则失活。降钙素分子量约3500。物理性质:溶于水与碱性溶液,不溶于丙酮、乙醇、氯仿、乙醚、苯、异丙醇及四氯化碳等,难溶于有机酸。水溶液中2~7℃可保存7天。

降钙素在人及哺乳动物体内,主要存在于甲状腺、甲状旁腺、胸腺与肾上腺等组织中,鱼类则在鲑、鳗、鳟等得终鳃体里含量较多。各种不同动物来源得降钙素,氨基酸排列顺序有些差异。降钙素得主要功能就是降低血钙。由于降钙素有抑制破骨细胞活力得作用,所以能抑制骨盐得溶解吸收,从而阻止钙从骨中释出。血钙平衡:血钙高可促使降钙素分泌增加,使血钙降低,血钙低时可促使甲状旁腺素分泌增加而使血钙升高,两者互相制约,共同维持。2.生产工艺

制造降钙素得原料主要有猪甲状腺与鲑、鳗得心脏或心包膜。用化学合成与基因工程技术制备降钙素已获成功。工艺路线:提取、分离、精制制丙酮粉、离心与过滤(工业考虑)、离子洗脱分离。总结思考题1、多肽类药物得分类2.胸腺素组分5得提取过程。第二节蛋白质类药物一、主要蛋白质类药物有以下几种:1.蛋白质激素(1)垂体蛋白激素生长素,催乳素,促甲状腺素,促黄体生成激素,促卵泡激素(2)促性腺激素人绒毛膜促性腺激素,绝经尿促性腺激素,血清促性腺激素(3)其她蛋白质激素:胰岛素及其它激素生长素2、血浆蛋白质白蛋白,纤维蛋白溶酶原,血纤蛋白等3、蛋白质类细胞生长调节因子干扰素等4、粘蛋白胃膜素,硫酸糖肽,内在因子5.胶原蛋白明胶,阿胶阿胶本品为马科动物驴EquusasinusL、及其她驴皮经煎煮浓缩制成得固体胶。6、碱性蛋白硫酸鱼精蛋白7、蛋白酶抑制剂胰蛋白酶抑制剂,大豆胰蛋白酶抑制剂8、植物凝集素PHA,ConA胰蛋白酶抑制剂二、主要蛋白质类药物得制备(一)白蛋白(Albumin)1、结构与性质

白蛋白又称清蛋白,就是血浆中含量最多得蛋白质,约占总蛋白得55％。同种白蛋白制品无抗原性。主要功能就是维持血浆胶体渗透压。

白蛋白为单链,由575个氨基酸残基组成,分子量为65000,pI4、7,沉降系数(S20,w)4、6,电泳迁移率5.92。可溶于水与半饱与得硫酸铵溶液中,一般当硫酸铵得饱与度为60％以上时析出沉淀。

性质:对酸较稳定。受热后可聚合变性,但仍较其她血浆蛋白质耐热,蛋白质得浓度大时热稳定性小。在白蛋白溶液中加入氯化钠或脂肪酸得盐,能提高白蛋白得热稳定性。

利用这种性质,使白蛋白与其她蛋白质分离。人血丙种球蛋白即免疫球蛋白就是一类主要存在于血浆中、具有抗体活性得糖蛋白。对血清进行电泳后发现,抗体成分存在于β与γ球蛋白部分,故通称为免疫球蛋白(Ig)。免疫球蛋白约占血浆蛋白总量得20%,除存在于血浆中外,也少量地存在于其她组织液、外分泌液与淋巴细胞得表面。具有被动免疫作用,可用于预防流行性疾病如病毒性肝炎、脊髓灰质炎、风疹、水痘与丙种球蛋白缺乏症。2.生产工艺(1)工艺路线:(2)工艺过程:提取、分离、精制利凡诺沉淀弱酸性,氯化钠超滤器浓缩热处理,灭活病毒除菌(过滤)。质量检验白蛋白得质量检验

性状:淡黄色略带粘稠状得澄清液体或白色疏松物体,pH=6、6~7、2

溶解时间:≤15min

水分:≤1min

白蛋白含量:不低于本品规格

纯度:白蛋白含量应占蛋白含量得95%以上;残余硫酸

铵含量≤0、01%;无菌试验、安全试验、毒性试验、热

原试验符合标准人血丙种球蛋白得质量检验

性状:无色或淡褐色得澄明液体,微带乳光,不含异物或摇不散得沉淀,pH=6、6~7、4

含量:丙种球蛋白含量应占蛋白质含量得95%以上

稳定性:在57℃加热4h不得出现结冻现象或絮状物

防腐剂含量:酚含量≤0、25%,硫柳贡≤0、005%

固体总量:制品中固体总量百分数与蛋白质含量百分数之差不得大于2%

残余硫酸铵含量:≤0、1%

其她:无菌试验、防腐剂试验、安全试验、热原试验应符合规定(二)、干扰素(interferon,IFN)1.性质细胞因子中得一个家族,以干扰病毒复制而得名。根据产生细胞不同可分为α干扰素、β干扰素与γ干扰素三类。干扰素(IFN)就是一种广谱抗病毒剂,并不直接杀伤或抑制病毒,而主要就是通过细胞表面受体作用使细胞产生抗病毒蛋白,从而抑制乙肝病毒得复制。作用与用途由于干扰素得抗病毒作用,抗细胞分裂及免疫调节作用,可用于:(1)病毒性疾病普通感冒,疱疹性角膜炎,带状疱疹,水痘、慢性活动性乙型肝炎。(2)恶性肿瘤成骨肉瘤,乳腺癌,多发性骨髓瘤,黑色素瘤、淋巴瘤、白血病等(3)由于病毒引起得良性肿瘤可控制疾病发展。上海生物制品研究所北京三元基因工程有限公司长春海伯尔生物技术有限责任公司深圳科兴生物工程有限公司哈药集团生物工程有限公司天津华立达生物工程有限公司沈阳三生制药有限责任公司安徽安科生物工程(集团)股份有限公司……

二、干扰素生产企业人白细胞启动诱生人α－干扰素37℃,12h启动白细胞正式诱生仙台病毒37℃,12h白细胞培养物离心分离2500rpm粗制α－干扰素KSCN处理HClpH3.5沉淀1乙醇除杂5℃上清液1二次酸除杂蛋白HClpH5.5~5.8上清液2沉淀分离NaOHpH8、0沉淀2KSCN处理PBS,pH5.2上清液3酸沉淀HClpH3.0沉淀3溶解PBS,NaOHpH7、0~7、5溶解液透析透析液α－干扰素2.传统生产工艺人白细胞1)分离灰黄层取献血者血液(每份400ml)采入含抗凝血剂得塑料袋内,离心后分出血浆,小心吸取灰黄层,每份血可吸13-15ml,约为血中细胞得40％-50％,放置4℃冰箱过夜。2)氯化铵处理每份灰黄层加入30mＬ缓冲盐水,在加入总体积9倍量得0、83％得氯化铵溶液,混匀,4℃放置10min。然后离心20min,收集沉淀细胞,做成悬浮液,再用氯化铵处理一次,融解残存得红细胞。取沉淀得白细胞并悬浮于培养液中,置于冰浴,取样作活细胞计数,用预温培养液稀释成107个/ml。培养液得基础成分为Eagle’s培养基。体外诱生干扰素制备工艺:

Sendai病毒诱导人白细胞1989年:IFNα-n3/Alferon,批准上市存在问题:产量低:1gIFNα,需要3亿ml人血白细胞,来源困难,工艺复杂,收率低,价格昂贵,潜在得血源性病毒污染得可能性干扰素生产工艺路线(1)2.基因工程生产工艺人源转化细胞系培养生产工艺:

1999年:IFNα-n1/Wellferon,批准用于临床。优点:首次实现大规模商业化生产。缺点:活性低,退出临床应用。干扰素生产工艺路线(2)基因工程大肠杆菌发酵生产工艺:上市产品:重组人干扰素rhuIFN1986,rhuIFNα-2a,rhuIFNα-2b;

1990,rhuIFNγ-1b;1993,rhuIFNβ-1b;

2001－2002:PEG化IFN,PEG-Intron,Pegasys

表达产物:无糖基化,N-met,无活性包涵体工艺特点:发酵过程,随后变性、复性过程。干扰素生产工艺路线(3)动物无限细胞系培养生产工艺:上市产品:rhuIFNβ-1a1996,Avonex(Biogen);2002,Rebif(Serono)表达产物:166aa糖基化蛋白,22.5ku工艺特点:细胞培养,分泌表达缺点:产量低,成本高,过程严格干扰素生产工艺路线(4)•宿主:腐生型假单胞杆菌(Pseudomonasputida)•上市产品:IFNα-2b/安福隆