DB37-T 6092-2026 非洲猪瘟病毒核酸检测 微滴式数字PCR

37Detectionofafricanswinefevervirusnucleicacid—DropletdigitalPCRI本文按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文的结构和起草规则》的规定请注意本文的某些内容可能涉及专利。本文的发布机构不承担识别专利的责任。李波、杨晓雪、赵鲁、李法凯、邢东义、王志刚、李明祯1非洲猪瘟病毒核酸检测微滴式数字PCRGB/T6682分析实验室用水规格和将含有核酸模板的标准聚合酶链式反应（PolymeraseChainReac以万计的微液滴，使每个反应中含有一个模板，然后进行单分子模板的PCR反应。含有模板的液滴在扩5.1.20.1mol/L磷酸盐缓冲液（PhosphateBufferedSaline，PBSpH7.4配制方法见附录A5.1.30.04mol/LPBS（pH7.4配制方法见A.2。5.1.450％甘油－PBS：配制方法25.1.10凝胶回收试剂盒。5.1.11琼脂糖。5.1.12DNAMarker。5.2材料5.2.1器械：解剖刀、剪刀、镊子、骨锯、注射器及针头、组织匀浆器等。5.2.3个人防护用具：防护服、防护镜、防护帽、5.2.4采样记录用品：采样单、记号笔、防水标签等。5.2.5其他：医用棉签、医用纱布、封口膜、冰袋等。采集病死猪或发病猪、同群猪的口、鼻拭子。用医用棉签在口腔或鼻腔转动至少3圈，密封后冷藏（2℃~8℃)或冷冻20℃以下）保存，长期保存应置－80℃超低温冰箱。3在每一发病猪群中，采集发病猪、同群猪全血各5mL，室温放置12h～24h，分离血清，装入离心管中，密封后冷藏（2℃~8℃)或冷冻20℃以下）保存。将所采集样品放入50％甘油－PBS保存液中，密封后冷藏（2℃~8℃)或冷冻（－20℃以下）保存，采集养殖场、屠宰场和无害化处理厂的环境样品，每个采样点采用棉签随机涂抹点不少于5个，将拭子浸入1mL50％甘油－PBS保存液中，剪去露出部分，盖紧离心管盖，密封后冷藏（2℃~8℃)或取适量采集的组织样品置于组织匀浆器中充分研磨，加入终浓度为1000IU/mL的青霉素、1000离心处理10min。取上清液，标记编号，立即进行ASFV检8.1.1质粒插入的目的片段p72ACGCATGTTCATCTATATCTGATATTAGCCCCGTTACGTATCCGATCACATTACCTATTATTAAAAACATTTCCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCGATAAATTTCCATCAAAGTTCTGCAGCTCTTACATACCCTTCCACTACGGAGGCAATGCGATTAAAACCCCCGATGATCCGGGTGCGATGATGATTACCTTTGCTTTGAAGCCACGGGAGGAATACCAA化质粒，转化感受态细胞中，挑选转化长出的菌落进行培养，提取质粒进行PCR鉴定，选择阳性重组质4将阳性重组质粒稀释到1.0×105拷贝/μL作为阳性对照模板，进行10倍梯度稀释，浓度分别为105采用DNA提取试剂盒或核酸提取仪提取核酸。如在2h内检测可将提取的核酸置于冰上保存，或-上游引物F：5’－AGTTCTGCAGCTCTTACATACC－3’；下游引物R：5’－GTGGCTTCAAAGCAAAGPCR扩增完成后，读取微滴数据。ASFV阳性对照模板和阴性对照的数字PCR检测结果示例见附ASFVDNA29℃min11519结果判定5进行ASFV核酸检测时，如样品处理、核酸提取等，6加去离子水至1000mL0.04mol/LPBS与纯甘油等量混合，调整pH值至7.4，分装成小瓶。103kPa高压蒸汽灭菌30min，7(资料性)ASFV阳性对照模板和阴性对照数字PCR检测结果ASFV阳性对照模板和阴性对照数字PCR检测结果见图B.1。