第14章--动物基因工程.ppt

1、动物基因工程,大连大学生物工程学院04（1）班主讲：孙贤标组员：王国丰、张万杰、于丽丽、王鑫、孙贤标,动物基因工程是利用DNA重组技术对动物所进行的工程操作。从遗传学角度分为：遗传性动物基因工程：外源基因能够通过配子进行垂直传递并稳定的遗传。非遗传性动物基因工程：转基因仅在当代表现，不能够遗传给子代。,第一节动物基因工程的发展状况与趋势,动物基因工程的实质是改变动物的遗传组成，增加动物的遗传多样性，赋予转基因动物新的表型特征，使能够更好地服务与人类社会。,世界首只转基因灵长类动物-安迪,世界第一只转基因动物,HBV转基因动物树鼩,从转基因的技术手段来看，除DNA显微注射法外，人们先后试过反转录

2、病毒载体介导法、精子介导法、胚胎干细胞介导法和核移植法等多种转基因方法。转基因细胞的核移植技术已经成为转基因动物生产的主流方法。,1、从简单的显微注射法向高效率的转基因体细胞核移植方向发展,转基因在基因组中的存在方式有两种，即随机整合和定点整合。为了达到外源基因的高效表达，在转基因结构上增加了含有位点控制区（LCR）、核基质附着区(MAR)等调控元件，可以实现插入位点非依赖性、拷贝数相关的表达模式。LCR和MAR的功能不受种属差异的限制，无论外源基因插入什么位点，都能够维持一个开放的染色体结构，有利于基因的表达。基因打靶技术的出现与发展，实现了对目的基因的定位操作。,2、从外源基因随机插入（或

3、整合）到定点整合的转变,从转基因的策略来看，动物转基因技术的发展经历了两个阶段：第一阶段为传统转基因动物阶段，第二阶段为条件性转基因动物阶段。借助转基因技术可将单一的功能基因和基因簇引入高等动物的基因组，或将目的基因从动物基因组中敲除，实现了种系内和种系间基因转移或修饰，产生新的基因型和表型。目前转基因动物主要应用在生物学基础研究、医学疾病模型、动物生物反应器、异种器官移植、动物遗传改良等个方面。,、从传统转基因到条件控制的转变,第二节转基因动物技术,一、动物基因工程载体二、基因转移技术,一、动物基因工程载体,作为动物基因工程载体必须具备以下几个功能：为外源基因提供进入受体细胞的转移能力为外源

4、基因提供在受体细胞内复制或整合的能力为外源基因提供在受体细胞内的扩增和表达能力,动物基因工程载体,质粒型表达载体病毒载体定向打靶载体,1.质粒型表达载体,表达载体的共同特点是都带有原核复制区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包括能在真核细胞表达的相关组件。一般包括转录外源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核细胞中的选择性标记，另外还增加了一些附加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受点，以保证外源基因的高效表达。,以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例,2.病毒载体,作为基因转移的病毒载体须具备以下基本条件：携带外源基因并

5、能够包装成病毒颗粒介导外源基因的转移与表达对机体不致病,（1）腺病毒（adenovirus）,腺病毒作为转染载体有许多特点：基因组的重排率低外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个周期安全性好，不会整合到人的染色体上，不导致肿瘤的发生宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要求不高外源基因在载体上容易高效表达,（2）腺相关病毒（adeno-associatedvirus,AAV）,腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒的共转染。无共转染时，野生型AAV优先（70%）整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组两端的ITR，以

6、及非结构基因编码的蛋白Rep78和Rep68的存在。,AAV具有以下几个方面特点：非致病性、无免疫原性和无炎症反应能感染静止期的细胞，如神经元细胞插入的外源基因表达时间长，一般能够达到1年之多宿主范围广热稳定性强，容易通过灭活辅助腺病毒纯化,（3）反转录病毒,反转录病毒是一种整合型单链RNA病毒，感染宿主细胞后，病毒颗粒中的pol基因表达出反转录酶，以单链的RNA基因组为模板，立即转录出一份线形双链DNA复本，然后在整合酶（Int）介导下，整合到宿主的基因组内，此时整和的病毒序列被称为前病毒。反转录病毒基因组整合到宿主细胞基因组后，其DNA随宿主DNA的复制而复制，并由5-LTR中的一个强启动

7、子转录出病毒RNA链，它既是病毒基因组，同时又具有mRNA模板活性，翻译出结构蛋白和反转录酶。在宿主细胞质中，两条相同的RNA链和反转录酶被包装与内壳中，形成的成熟病毒颗粒以芽植方式分泌至细胞外，但通常不致死宿主细胞。,3.定向打靶载体,基因打靶是通过外源基因与靶细胞染色体上的同源序列间的同源重组，将外源基因定点整合到靶细胞特定位置上，而使某一个特定位点上的基因发生定点突变的技术。在细胞内存在两条相同的DNA链（同源染色体），在细胞内酶的作用下，可以将其切开，发生交叉，然后重新连接，从而发生DNA链的交换并引发重组。,（1）基因敲除,敲除型载体由两段与基因组内靶基因座序列同源的DNA片段（又称

8、同源臂）组成，中间为正向选择标记，同缘臂外侧为真核细胞中的负选择标记及在原核细胞中进行复制与筛选的载体DNA序列。,（2）基因敲入,基因敲入是利用同源重组原理将外源基因插入到染色体的特定位点上。基因敲入的转基因结构设计上相似于基因敲除结构，但区别在于：或用外源基因替换并失活靶基因或在不影响拔基因功能的前提下插入新的基因或在染色体上特定位点插入新的外源基因，从而实现基因转移，并使得外源基因高效表达,（3）基因下调（knock-down）,RNA干扰（RNAinterference，RNAi）又被称为基因下调，通过干扰RNA（smallinterferencesiRNA）分子的作用达到转录后基因沉

9、默的效应。siRNA的制备方法主要包括体外合成siRNA和siRNA表达载体两种。体外合成的siRNA易转染细胞，进入细胞后，可直接发挥作用，一般不存在siRNA表达载体的转录效率低及细胞毒性等问题。但是体外合成的siRNA只能瞬间干扰，不能达到长久抑制病毒的效果。,二、基因转移技术,物理转染法化学转染法生物法,1.物理转染法,（1）电击法（electroporation）其基本原理是在外加电场的作用下，细胞膜电位发生改变，细胞质膜瞬间出现可逆性的电穿孔，从而使一定数量的外源DNA从细胞外扩散到细胞质和细胞核内，并进一步整合到宿主DNA上，达到转基因目的。,图1.利用点穿孔法进行基因转移,（2

10、）显微注射法是将外源DNA在显微镜操作系统的辅助下，通过玻璃微管直接将外源DNA注入哺乳动物受精卵的原核内，使外源基因整合到基因组上，制备转基因动物。,（3）基因枪法基本原理是将要转染的DNA吸附到高黏度的金属（钙或金等）颗粒上，在一种加速装置的作用下，将这些粒子高速打入细胞或组织内，达到转基因目的,（4）超声波法（sonoporation）超声波增强基因转染法的主要机制是声波的空化效应导致细胞的通透性增高，而通过添加超生造影剂能降低空化域值，增强空化效应，促进外源基因进入细胞，提高基因的转染效果,2.化学转染法,（1）磷酸钙法将待转染的DNA溶解在磷酸缓冲液中，加入CaCl2后，DNA片段与

11、磷酸钙共沉淀并形成大的颗粒；将此颗粒悬浮液加入贴壁培养的细胞中，外源DNA就被靶细胞所吸收，进而实现转基因。,图2.利用磷酸钙共沉淀法进行DNA转染,图3.质脂体介导的基因转移,（2）脂质体法（lipofection）,将待转染的DNA溶液与磷脂混合，后者在表面活性剂存在下形成包埋水相DNA的脂质体结构。当这种脂质体悬液加入到细胞培养液中，便会与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质或细胞核内。,（3）原生质体融合法含有目的基因的质粒转化细菌或酵母细胞。大量扩增，利用溶菌酶或蜗牛酶去除胞壁部分，在高盐条件下制成原生质体，然后散铺在单层培养的哺乳动物细胞上，在融和剂（如聚乙二醇）作用下，使

12、染色体或质粒转如细胞内，实现转基因,构建含有选择性标记的反转录病毒基因组部分DNA与质粒的杂合型载体分子，在多克隆位点插入外源基因形成重组DNA分子，克隆到大肠杆菌中扩增鉴定；重组DBA分子通过物理或化学方法转入一个特制的病毒包装细胞系。转染入包装细胞系的重组DNA转录出相应的重组RNA分子，包装细胞系分泌出来的重组反转录病毒，便可感染其他类型动物受体细胞，重组RNA分子以DNA形式整合到染色体上，并表达外源基因。,3.病毒感染法,图4逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因,原病毒DNA转染进包装细胞中，包装原病毒产生将病毒RNA包装成感染性病毒粒子的所有蛋白质，但却不能包装自身的RNA,第三节

13、转基因动物制备,转基因动物的制备程序转基因鉴定表达水平的检测转基因动物传代与检测,一转基因动物的制备程序,DNA显微注射法制备转基因小鼠胚胎干细胞法制备转基因小鼠转基因体细胞核移植法生产转基因牛,1、DNA显微注射法制备转基因小鼠,超数排卵基因制备胚胎移植显微注射转基因个体的鉴定,显微注射技术,2、胚胎干细胞法制备转基因小鼠,胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团中分离出的未分化、具有正常二倍体染色体和发育全能性的细胞。优点：可以在体外进行人工培养、长期扩增、冷冻保存,胚胎干细胞制备转基因动物过程,（1）转基因胚胎干细胞的获得（2）囊胚注射（3）嵌合体的检测和育种转基因嵌合个体的制备目的是为了获得转基

14、因后代,胚胎干细胞基因转化法(引自G1ick&Pasternak，1998),判断是否是种系嵌合首先用转基因嵌合体的小鼠与正常的小鼠交配，对其后代进行检测，如果后代中有转基因个体出现，证明为种系嵌合，然后将转基因杂合子个体进行横交就会获得转基因纯合子和杂合子个体。如果在后代中没能发现转基因纯合子，应注意是否因为转基因的纯合造成了胚胎的早期死亡，无法得到成活个体所致。,基因的准备,供体细胞获取,传代培养、扩增,供体细胞的转基因,转基因供体细胞的筛选与扩增,卵母细胞的获得,体外成熟培养,卵母细胞的去核,核移植,重构胚体外培养,胚胎移植,获得转基因个体,3、转基因体细胞核移植法生产转基因牛,二转基因

15、鉴定,标记筛选法（1）正负选择标记筛选法（2）无启动子筛选法利用靶基因上的启动子来转录标记基因的mRNA并翻译出特定的蛋白质，而达到筛选的目的。分子鉴定法（1）PCR扩增（2）斑点杂交（3）Southern杂交（4）荧光原位杂交,三表达水平的检测,获得高效表达、具有较强生物学活性的目的是蛋白是转基因的主要目的之一。得到的目的蛋白的的形式：表达于细胞内，可通过对组织或细胞裂解获取；分泌到细胞外，可通过酶学或免疫学方法进行测定。,1、报告基因报告基因是编码容易检测的蛋白质的核苷酸序列，一般用以替换难于测定的蛋白质基因，或制备融合蛋白，或利用IRES与目的蛋白形成一条mRNA序列，分别翻译出两种蛋白

16、，来研究目的蛋白的功能及其表达特性。,2、Northern杂交可以检测转基因动物或转染细胞是否转录出目的基因所对应的mRNA3、反转录PCR（RT-PCR）是将由mRNA反转录产生的cDNA第一链为模板进行目的基因或片断扩增的PCR反应。利用RT-PCR方法扩增出目的基因的电泳条带，以检测目的基因是否表达。,4、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析靶组织或转基因细胞的总蛋白，依据相对分子质量标准判定是否有目的蛋白条带出现，进而判定外源基因的表达情况，同时可以初步判定目的蛋白的表达水平。5、Western杂交可用来检测混合蛋白质样品中是否存在目的蛋白，最小检出量为1ng。6、目的蛋白的生物活性应选择相应的生物

17、学测定方法进行测定。当产品生物学活性较天然蛋白活性低时，应当对蛋白质结合的功能分子集团进行研究。,四转基因动物传代与检测,判断是否生产出转基因动物的重要标准是检查外源基因是否整合到动物的生殖系统中，即是否能够稳定遗传。转基因动物传代常用常规繁殖方法进行，如有必要，也可采用特殊的方法。一般用转基因检测阳性动物与已知的非转基因动物交配，这样做可以较好的度量被整合的外源基因的传递规律。,第四节转基因动物的应用与未来,一、转基因动物的应用二、转基因动物的生物安全性三.动物转基因的未来,一、转基因动物的应用,提高动物的生产性能（1）改良畜禽生产性状在转基因“硕鼠”的启发下，人们试图通过外源基因的导入提高

18、畜禽产品产量，加快生长速度，减少饲料消耗和改良产品品质。（2）提高畜禽抗病力传染病的流行以及动物源性人畜共患病的爆发，已对畜牧生产和人类生活产生了巨大的影响。,转基因“硕鼠”（右）,转基因鱼,转基因牛,转基因猪,2.动物生物反应器,转基因动物的出现引导人们试图把转基因动物作为一种生物反映器，生产人类所需的医用珍贵稀有蛋白，特别是医用活性肽。,能生产人促红细胞生成素的转基因牛,乳汁中分泌人凝血因子IX的转基因山羊,美国转基因猪，其体内含有人类的基因，乳汁含有人体蛋白fator。只需300600只这样的母猪就能满足全世界对这种蛋白的需求。,3.异种器官移植,英国苏格兰罗斯林研究中心培育出的5只转基因小猪通过基因工程的手术，将猪的一个基因阿尔法1号(GT基因)“关闭”,4.基础研究,利用转基因技术可建立敏感动物品系及生产与人类疾病相同的疾病动物模型，可用于新型药物的筛选，表现出准确，经济，实验次数少，显著缩短试验时间等优