土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.ppt

1、课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数,一、课题背景,尿素是怎样被植物吸收的？,尿素CO(NH2)2,只能被分解为NH3才能被植物吸收利用,产生脲酶的细菌即为能分解尿素的细菌,任务1：怎么从土壤中分离出它们呢？,二、研究思路,阅读课本P21，感悟科学家寻找耐高温的DNA聚合酶给你的启示。,（一）筛选菌株,方法：人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物的生长。,根据这一思路，你能否将土壤中分解尿素的细菌分离出来，说说你的思路。,利用以尿素为唯一氮源的培养基进行筛选。,能。只有产生脲酶的细菌才能利用尿素作为氮源而生存。,此培养基能否筛选出产生脲酶的细菌？

2、为什么？,KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖10.0g尿素1.0g琼脂15.0g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1000mL。,（1）将土壤中的固氮菌分离出来,（2）将土壤中自养微生物分离出来,举一反三,（3）筛选出抗青霉素的微生物,（4）筛选出耐高浓度食盐的微生物,（一）筛选菌株,1、利用选择培养基筛选,选择培养基：允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。,1、利用尿素作为唯一氮源的培养基分离出的微生物只是一种细菌吗？都是能分解尿素的微生物吗？,思考：,不是，有多种。,芽孢杆菌、小球菌、假单胞杆菌、克氏杆菌、棒状杆菌、梭状芽

3、孢杆菌，某些真菌和放线菌也能分解尿素。,不一定。因为有些微生物可以利用其他微生物的代谢产物进行生长繁殖。,因此，还需借助生物化学方法对分离的细菌作进一步的鉴定。,2、请你提供一种方法，判断分解尿素的细菌确实能将尿素分解成氨。,思考：,方法：在以尿素作为唯一氮源的培养基中加入酚酞指示剂,接种培养该细菌，若指示剂变红，说明该种菌分解了尿素。,3、要验证以尿素为唯一氮源的培养基对土壤中的细菌确实具有选择作用，你该如何设计实验。,思考：,思路：制备牛肉膏蛋白胨培养基作为对照组，尿素为唯一氮源的培养基为实验组，接种等量的从同一土壤中采集的细菌，培养、计数并比较两组培养基上的菌落数。,任务2：统计每克土壤

4、样品中究竟含有多少这样的细菌？,计数法,显微镜直接计数法稀释涂布平板法膜过滤法,1、显微镜直接计数,利用血球计数板，在显微镜下计算一定容积里样品中微生物的数量。,不能区分死菌与活菌；不适于对运动细菌的计数；需要相对高的细菌浓度；个体小的细菌在显微镜下难以观察；,缺点,2.稀释涂布平板法（活菌计数法）原理：在稀释度足够高时，微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个单细胞繁殖而成的，即一个菌落代表原先的一个单细胞。,（2）计算：每克样品中的菌落数(CV)M其中，C代表某一稀释度下平板上生长的平均菌落数，V代表涂布平板时所用的稀释液的体积(ml)，M代表稀释倍数。,讨论,对同一细菌培养液样品分别

5、用显微镜直接计数法和稀释涂布平板法测定其菌体数量，你认为两种方法所测数据有何差异？,（1）操作方法：稀释涂布平板法（2）原理：1个菌落1个活菌（3）注意事项,（二）统计菌落数目,真是这样吗？,注意事项为了保证结果准确，一般选择菌落数在30300的平板上进行计数。为使结果接近真实值可将同一稀释度加到三个或三个以上的平皿中，经涂布，培养计算出菌落平均数。统计的菌落往往比活菌的实际数目低。涂布平板法所选择的稀释度很重要，一般以三个稀释度中的第二个稀释度所出现的平均菌落数在50个左右为最好。,例：两位同学用稀释涂布平板法测定同一土壤样品中的细菌数。从对应稀释倍数为106的培养基中，得到以下两种统计结果

6、。1、甲同学在该浓度下涂布了一个平板，统计的菌落数为230。2、乙同学在该浓度下涂布了A、B、C三个平板，统计的菌落数分别为21、212、256，该同学以这三个平板上菌落数的平均值163作为统计结果。你认为这两位同学的作法正确吗？如果有问题，错在哪？,甲：没有重复实验（至少涂布3个平板）乙：A组结果误差过大，不应用于计算平均值,?,设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。,设置对照,实例：在做分解尿素的细菌的筛选与统计菌落数目的实验时，A同学从对应的106倍稀释的培养基中筛选出大约150个菌落，但是其他同学在同样的稀释度下只选择出大约50个菌落。分析其

7、原因。,原因：土样不同，培养基污染或操作失误(或者是混入了其他的含氮物质),小结：通过这个事例可以看出，实验结果要有说服力，对照的设置是必不可少的。,方案一：由其他同学用与A同学相同土样进行实验,方案二：将A同学配制的培养基在不加土样的情况下进行培养，作为空白对照，以证明培养基是否受到污染。,结果预测：如果结果与A同学一致，则证明A无误；如果结果不同，则证明A同学存在操作失误或培养基的配制有问题。,三、实验的具体操作.土壤取样从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。取土样用的小铁铲和盛土样的的信封在使用前都要灭菌。.制备培养基：制备以尿素为唯一氮

8、源的选择培养基。,应在火焰旁称取土壤10g。在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行,分离不同的微生物采用不同的稀释度原因：不同微生物在土壤中含量不同目的：保证获得菌落数在30300之间、适于计数的平板,三样品的稀释,为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？,原因：土壤中各类微生物的数量（单位：株/kg）是不同的。例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。结论：为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择

9、培养的条件。,.取样涂布,实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。,如果得到了2个或2个以上菌落数目在30300的平板，则说明稀释操作比较成功，并能够进行菌落的计数，如果同一稀释倍数的三个重复的菌落数相差较大，表明试验不精确，需要重新实验。,.微生物的培养与观察,在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。,培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌：3037培养12d放线菌：2528培养57d霉菌：2528的温度下培养34d。,微生物的培养与观察,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,关注菌落的形态、大小、边缘、突起、颜色、质地等等，都是区分细菌的重要手段。,四、结果