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文档简介

1、,ELISA原理,基本原理 它采用抗原与抗体的特异反应将待测物与酶连接，然后通过酶与底物产生颜色反应，用于定量测定。测定的对象可以是抗体也可以是抗原。,一、ELISA原理,二、ELISA的类型,ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有三个必要的试剂： （1）固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂（immunosorbent）； （2）酶标记的抗原或抗体，称为“结合物”（conjugate）； （3）酶反应的底物。 可设计出各种不同类型的检测方法。,1.将抗原包被在固相载体上。 2. 加入含抗体的样品，结合为抗原抗体复合物。 3.再加入酶标记抗抗体，则结合为抗原- 抗体-酶标记抗

2、抗体复合物。 4. 酶底物催化显色。,间接法,三、生物素-亲合素放大技术,亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。由于1个亲和素分子有4个生物素分子的结合位置，把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大提高ELISA的敏感度。,固相上先预包被链霉亲合素，原用包被固相的抗原与生物素结合，通过亲和素生物素反应而使生物素化的抗原固相化。这种包被法不仅可增加吸附的抗体或抗原量，而且使抗原的结合点充分暴露。,封闭(blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体包被时所用的浓度较低，吸收后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是

3、让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。,四、注意事项,加样: 在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。,温度 抗原抗体完成反应的温度 应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。,洗涤,洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干

4、扰物质洗涤下来。 可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。,对照设定,阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。 阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。 加入的量应与试剂的敏感度相称； 在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。,显色,显色是酶催化无色的底物生成有色产物的温育反应。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。适当提高温度有助于加速显色进行。,比色,拭干板底附着的液体，然后将板正确放入酶标比色仪中。,Phaget梯

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