常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍

1、.常用分子生物学和细胞生物学实验技术简介(2011-04-23 113333003333629)标签：分子生物学细胞生物学一般使用实用技术基础实验室技术生物学实验教学常用分子生物学基本技术核酸分子杂交技术核酸分子杂交的高特异性和检测方法的敏感性，是分子生物学中最常用的基本技术，广泛应用于基因克隆筛选、酶切图谱构建、基因序列的定量和定性分析、基因突变检测等。基本原理是，在特定条件下(适当的温室和离子强度等)，具有特定同源的原始核酸单链可以有基本互补的原始双链。杂交对象是正在检测的核酸序列和探针(probe)，正在检测的核酸序列可以是克隆的基因信息部，也可以是未复制的基因组DNA和细胞总RNA。核

2、酸探针是指已知的DNA或RNA片段，这些片段标记为放射性核素、生物素或其他活性物质，能与特定核酸序列进行特异性互补。根据其起源和特性，可以分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。固相杂交固相杂交(solid-phase hybridization)把改性DNA固定在固体基质(硝化纤维素膜或尼龙过滤器)上，然后与探针杂交，称为膜上印迹杂交。斑点混合(dot hybridization)首先，使经过测试的DNA或RNA变性，然后固定在滤膜上，然后放入标记过多的DNA或RNA探针杂交。其特点是简单的操作，无需酶消化或凝胶电永久分离核酸样品，即可在一个膜中同时检测多个样品。根据斑点混

3、合的结果，可以估计杂交阳性副本的数量。该方法的缺点是无法确定被测试基因的相对分子质量，特异性下降，存在一定比例的假阳性。压印混合(blotting hybridization)Southern blotting hybridization:凝胶电离使受限制性内切酶消化的DNA片段电离，将单链DNA片段原位转换为硝化纤维素膜或其他固体支撑物，干燥后烘焙固定，然后与对应于该结构的探针相互作用，通过放射性自身现象或酶反应检测特定大小的分子含量。可以进行克隆基因的酶切分析，基因组基因的定性和定量分析，基因突变分析和限制性长度多态性分析(RELP)。Northern blotting hybrid :是

4、从Southerm print hybridization演化而来的，样本是RNA。被甲醛或聚糖酰化改性和电泳分离后，移至固相支撑物进行杂交反应，确认飞机内特定mRNA分子的数量和大小。这是排斥基因表达程度的基因表达研究中常用的方法。差异混合(differential hybridization)将基因组库中的重组噬菌体DNA转移到硝化纤维素膜，将转移性和非转移性癌症组织的mRNA逆转录cDNA等两种混合cDNA探针分别与滤膜的DNA杂交，分析两个滤膜的相应位置杂交信息，分离差异表达的基因。对于基因组不太复杂的真核生物(如酵母)表达基因的比较，假阳性率较低。但是，像人一样，基因组非常复杂的盐酸

5、核生物，工作量太大，表达顺序低(只有5%左右)，价值不大。CDNA microarray hybridizationcDNA克隆或CDNA的PCR产物以高度排列的形式排列，结合固相支撑物(例如尼龙薄膜或活动幻灯片)，制成微型光栅，然后混合不同的DNA探针，与微型光栅的DNA杂交。利用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等扫描微型光栅的杂交信息。与差异混合技术相比，效率更高、速度更快、成本更低，适用于大规模分析。商品已经上市了。也有不能克服对保守同族序列和杂交信息的中旬扰动的缺点。oligo nucle otide microarray hybridization s将核糖核苷酸原位合成在特殊的固相支持

6、物上，并结合在支持体表面，与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针杂交，提高杂交的特异性和敏感性。使用共聚焦显微镜检测分三个阶段的杂交信息。区分基因家族不同成员的差异表达特性，或确认在同一组织及细胞中转录的选择性结合部，适合低丰度mRNA的检测。有工作量大、费用高、速度慢的弱点。液体杂交(solution hbridization)酸单链(探针)，又称变性核酸单链及放射性核素标记，在溶液中绝热，形成杂交复合物。反应结束后，通过羟基磷灰石法或酶水解，分离出未杂交的单链和杂交双链，然后制作横膈膜后，其他化妆分子中测定探针程度的核酸量。递减混合(subtractive hybridiza

7、tio)是利用两个具有不同稳态的组织细胞提取mRNA(或反转录cDNA)，在一定条件下，过量驱动mRNA或cDNA，与经测试的短链cDNA或mRNA进行液相杂交，通过羟基磷灰石色谱筛选去除两者之间同源的杂交体通过多次杂交政策，去除其间的相同基因成分，保存特定表达的目的基因或工作基因片段。此后筛选cDNA库，可以获得特定表达的目的基因cDNA全长序列。核酸原位杂交技术的研究。以核酸(特定标记的已知顺序)为探针，在细胞级或组织切片中杂交和检测核酸和核糖核酸的方法称为核酸内杂交(简称situ)。与细胞内RNA杂交，研究细胞内特定基因表达的秀润，用于确定细胞核或染色休相中DNA的分布。还用于细胞，组织

8、内非特异性细菌，病毒检测研究。该方法的优点是特异性高，能准确定位。无论同一组织的其他组成部分如何，都可以在构成复杂的组织中进行单细胞研究。不需要从组织中提取核酸，对组织含量极低的目标顺序非常敏感。能完美地维持组织和细胞的形态。因此，它被广泛用于基因定位、基因丢失、基因移位、特异性基因整合部物色检测等医学生物学研究。近年来，在质的发展中，数量、方法进一步改进。DNA分子克隆技术(也称为基因克隆技术)将DNA分子片段与向量DNA片段联系起来，使DNA分子克隆(或基因克隆)在细胞的大量复制过程中发生。其基本步骤包括“准备目的基因”“将目的基因和载体切割并连接成限制性内切酶”“导入宿主细胞”“筛选”，

9、“鉴定”“扩增并表达”等。载体(vecors)在细胞内自我复制，把重组后的分子片段增殖在一起，形成很多DNA分子片段。主要目的是获取特定基因或NDA片段的大量拷贝，通过与父母分子完全相同的分子克隆深入分析基因的结构和功能，根据引入的DNA片段，有两个DNA库：基因组库和cDNA库。载体是带目标DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。细菌质粒是细菌染色体外的小双链环结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的特定代谢活动和耐药性表型有一定的作用。质粒载体是以天然质粒为基础进行人工变形结合的。最常用的质粒是pBR322。噬菌体是感染细菌的病毒，根据生活周期分为溶解细菌和溶解原型两种。野生型噬

10、菌体转化制成的噬菌体载体是线性双链DNA，基因组约为50kb，最常用的亚型是DNA及其衍生物系列。粘弹性质粒(Cosmid)是由质粒和噬菌体DNA组成的4-6kb环杂交DNA。表达载体将上述细菌质粒或噬菌体载体连接到启动基因及聚核糖体的基因序列，构成表达载体。基因银行建设包含某一生物所有基本日历的随机片段的重组DNA复制群体包含对光敏感的基因片段的重组包含标记探针与基因池中的重组杂交而获得的克隆经过纯化和扩增，可以用于一步研究。主要步骤如下：(1)基因池的快速载体构建；(2)DNA片段的制备；(3)DNA片段与矢量DNA的连接；(4)包装和免疫。构建CDNA库是指复制的DNA片段，逆转录酶是m

11、RNA制造的cDNA。cDNA库包含特定细胞所有CDNA复制的库，不包含人体。特定基因的筛选一般方法如下：(1)克隆筛选，即探针筛选方法；(2)分泌蛋白质筛选目标基因的抗体检测方法；(3)放射免疫筛选方法检测分泌特定抗原的基因；(4)免疫沉淀法，特定基因筛选。核酸序列分析DNA的碱基序列决定基因的特征，分子生物学的重要基本技术“测序”就是其DNA序列分析。基因池中被选择的肿瘤基因或PCR扩增的基因最终通过核酸序列分析，了解基因的精密结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因突变及其对功能的影响，人工海马体由基因制成，设计引物，研究肿瘤的分子病因。测序是在高分辨率改性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上制

12、作的。目前最常见的方法是Maxam-Gilbert的化学分解和Sanger的双脱氧方法等，近年来出现了DNA序列自动分析仪。化学分解法在DNA片段的5端标记核素，然后用特异性化学试剂对DNA进行特异性分解，利用电泳及自行开发后从标记端延伸的片段，获得读取顺序，进行比较。你通常可以阅读200到250个核苷酸序列。2 ，在3- ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP的情况下，通过使用核苷酸链终止剂混合到DNA链中，结束链延长，将4种正常dNTP混合的混合物分成4个组，进行反应，读取凝胶电泳分离和发射的合成DNA核苷酸序列，可以根据碱基互补原则估计模板DNA化学分解法只需要化学试剂，重复性好

13、，容易掌握。双脱酸消化方法需要单链模板、特定寡核苷酸引物和高质量DNA聚合酶，因此根据M13噬菌体载体的发明和使用，合成引物容易获得，排序技术不断改进，得到广泛应用。自动激光荧光排序可以快速简便地进行测量工作，并确保高重复性。RNA测序通常使用将mRNA逆转为cDNA，然后通过相同的测序逆转RNA序列的方法聚合酶链反应技术被称为PCR技术的聚合酶链反应技术利用DNA变性和复性原理，在体外高效扩增特定DNA片段，检测出微量目标序列，数量不超过一个。模板DNA、引物及4种脱氧核糖核苷酸存在的条件下，依赖DNA聚合酶的酶合成反应。只需很少的模板，就可以在一对引物参数下，在几个小时内增强到100-20

14、0万个拷贝。PCR反应分为变质、退火和扩张三个阶段。上面的第三步是使用循环，每个循环的产物作为下一个模板，使用9个小时的循环，每个循环的产物作为下一个循环的模板，在经过几个小时的循环后，可以得到大量复制的特定DNA片段。反应条件通常为94变性30秒，55 退火30秒，70 72 延长30 60秒，共循环约30次，最后在72延长5分钟，4冷却终止反应。1.RNA扩增中使用的逆转录PCR(RT-PCR)。2.反转录PCR(competitive reverse transcription-polymerase chain rection c-rt-PCR)低丰度RNA定量化的好方法。3.将多对引物

15、添加到多个多PCR(PCR)相同的PCR系统中会导致默认长度较长、缺少多个引物吗？Br4.多个PCR同时添加多组生物素标记引物，引起水速PCR反应。5.反向分子链反应(I verse polymerase chain reaction，pcr)放大和研究已知DNA片段两侧的未知序列。6.不对称PCR在扩增周期中引入不同的引物浓度，获得单链DNA，了解目标基因的序列。7.锚定的分段式机箱更改(PCR)有助于克服未知序列或未知序列导致的故障。在未知序列的末端添加均聚物尾部序列，将互补引物连接到具有限制性内切酶部位的一个锚，在锚引物和基因另一侧的特定引物的作用下，扩增未知序列。8.彩色互补检测或荧光

16、荧光荧光荧光PCR(颜色组合assay or fluorescent PCR)的原理是，用不同的荧光染色分别升高，贴在不同的寡核苷酸引物上，同时扩增多个DNA片段，反应结束后，使用分子筛选去除多余的引物。如果用紫外线照射放大产物，可以显示在某个DNA部位组合荧光染料颜色，在某个DNA部位组合荧光染色剂颜色，如果缺少某个DNA带，就会相应地缺乏颜色。9.双温度two-temperature PCR(PCR)仅执行两阶段温度程序。组合退火和扩展温度。常用温度为94-95 和46-47 。能提高反应的速度和特异性。这些PCR技术的应用：(1)PCR技术放大特定序列，使用多种方法(如PCR-RFLP、PCR-SSCP)从克隆的双链DNA中生成特定序列作为分子探针。(2)在cDNA中选择性扩增特定序列，用作分子探针。(2)选择性扩增cDNA的特殊片段，为尚未复制的基因生成探针。(3) cDNA文库由微mRNA生成。(4)大量DNA用于序列分析；生成。(5)基因突变分析；(6)采取染色体阶段。10.in situ PCR技术：PCR可以扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织在内的各种标本的DNA，但扩增的DNA或RNA产物不能位于组织细胞中，因此不能直接与特定组织细胞特性相关，这是该技术的局限性。In situ hybridization的定位力很好，但还不能检测