WB原理、步骤及总结

1、实验原理蛋白质印迹技术是将电泳分离的蛋白质转移到固定的底物上，然后利用抗原抗体反应检测特定的蛋白质分子。它包括三个部分：聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质电泳转移和蛋白质印迹分析。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳主要用于测定蛋白质的相对分子质量。SDS是一种阴离子去污剂，它能破坏蛋白质内部和蛋白质之间的氢键，使分子展开并破坏其高级结构。SDS与大多数蛋白质的结合比为1.433601。由于SDS带有大量负电荷，当SDS与蛋白质结合时，不同种类蛋白质之间原有的电荷差异被掩盖，因此所有种类的蛋白质都带有相同密度的负电荷，形状像长椭圆形的棒。蛋白质迁移率与蛋白质相对分子质量的对数成线性关系。因此，未知蛋白质的相对分

2、子质量可以通过使用相对分子质量标准蛋白质制作的标准曲线来获得。电泳后，蛋白质分子嵌入凝胶介质中，探针分子难以通过凝胶孔。蛋白质可以从凝胶转移到固定基质上进行免疫分析。有两种方法：水平半干转移，即凝胶和固定基质夹在浸泡在缓冲液中的滤纸之间，通电10-30分钟即可完成；垂直湿转移，即凝胶和固定基质夹在滤纸之间，浸入转移装置的缓冲溶液中，通电2-4小时或过夜即可完成。固定基底通常包括硝酸纤维素膜、聚偏氟乙烯膜和尼龙膜。将蛋白质转移到固定化膜后，用蛋白质染料如李春红S检测膜上的总蛋白质，或用考马斯亮蓝检测凝胶上的蛋白质残基，以验证转移是否成功。用抗体作为探针进行特异性免疫反应检测抗原蛋白分为四个步骤：

3、用非特异性和非反应性分子封闭固定化膜上非吸附蛋白的自由结合区，防止抗体作为探针与膜结合；检测时背景高；将固定化膜与特异性一级抗体孵育，使一级抗体与膜上的抗原蛋白分子特异性结合；将酶标记的第二抗体与第一抗体特异性结合；加入酶底物，适当保温，膜上可见显色反应，检测抗原蛋白带。主要解决方案10%分离凝胶3.3毫升水、4.0毫升30%丙烯酰胺混合物、2.5毫升1.0摩尔/升tris (ph 8.8)、0.1毫升10% SDS、0.1毫升10%过硫酸铵和0.004毫升temed5%浓缩口香糖水2.7毫升，30%丙烯酰胺混合溶液0.67毫升，1.0毫升/升Tris0.5mL毫升，10% SDS 0.04毫

4、升/10%过硫酸铵0.04毫升，TEMED0.004mL毫升1色氨酸-甘氨酸电泳缓冲液Tris碱3.03克，甘氨酸18.77克，十二烷基硫酸钠1克，用去离子水定容至1 l2SDS凝胶样品添加缓冲液三盐酸(pH6.8)100摩尔/升，-巯基乙醇10%，甘油10%，溴酚蓝0.01%，十二烷基硫酸钠10%转移缓冲器Tris 2.45g克，甘氨酸11.25克，甲醇100毫升，加入去离子水至1升TBSTTris 1.21g克氯化钠8.77克，吐温-21毫升，加入去离子水至1L脱模1.3毫升Tris (pH 6.8)，4毫升10%十二烷基硫酸钠，140升-巯基乙醇，加水定容至20毫升实验步骤1 SDS-聚

5、丙烯酰胺凝胶电泳(1)凝胶构型(1)隔离胶的配置：将配制好的隔离胶溶液混合均匀，迅速倒入胶槽中，直至距短玻璃板顶部约2厘米，停止倒胶。检查是否有气泡，如果有，用滤纸条吸出。然后向胶液界面加入蒸馏水进行水封。15 30分钟后，凝胶与水封层之间的界面清晰，表明凝胶已经完全聚合，然后用滤纸吸住水封层，滤纸不得接触凝胶表面。(分离蛋白质样品)(2)浓缩胶的配置：将配制好的浓缩胶倒在分离胶上，直到短玻璃板的顶部，然后将其插入样品槽梳中。浓缩胶在室温下聚合约20-30分钟。(浓缩蛋白质样品)(2)蛋白质样品的处理将蛋白质样品溶解在最终浓度为0.5-1毫克/毫升的样品溶解溶液中。然后转移到一个小离心管中，轻

6、轻合上盖子(不要太紧，以免液体在加热过程中爆裂3)，在100的沸水浴中加热3分钟，取出并冷却以备后用，使用前离心样品以去除颗粒物质。如果暂时没有，可以在-20的冰箱中长时间保存，并在沸水浴中加热3分钟，以除去亚稳定的聚合物质。装载前的样品必须均匀，以防止电泳过程中出现纵向条带。(3)样品添加从样品槽中取出梳子，倒入电极缓冲溶液，并将短板覆盖0.5厘米以上。如果样品槽中有气泡，用枪头将其取出。将标准蛋白和未知蛋白样品依次加入凝胶样品罐。每个孔的样品添加量应该相同。样品添加量一般为10 30升。在样品添加过程中，枪头尽可能靠近底部深入样品添加槽，并记录样品添加顺序。(4)电泳上槽连接到负电极，下槽

7、连接到正电极，并且DC稳定电源接通。80V通过浓缩凝胶后，变为120V。当溴酚蓝指示剂沿凝胶下边缘迁移至1cm时，电泳停止。蛋白质的电转移(1)水平半干式电气传输戴乳胶手套切割6张滤纸，滤纸的长度和宽度比SDSPAGE胶大1cm。(2)切割长度和宽度与SDSPAGE胶相同的数控薄膜。(3)将3张滤纸和十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶浸泡在负转移溶液中，以备后用。(4)将另外3张滤纸和数控转移膜浸泡在正转移溶液中备用。(5)取出浸泡在负转移液中的滤纸，取尽可能少的液体，放在转移槽的负极上，然后在负滤纸上依次铺上SDSPAGE胶、NC膜和3张浸透正转移液的滤纸。应注意消除气泡，因为气泡会产生高阻抗点

8、，并形成低效率的印迹区域，称为“秃斑”。盖住石墨阳极板，设定50mA的恒定电流，并转移一段时间。(2)垂直湿转移(1)凝胶片的平衡：将电泳后的凝胶从玻璃板上转移到装有适量转移缓冲液的大培养皿中，浸泡30-60分钟，除去凝胶中的十二烷基硫酸钠，使其酸碱度和离子强度与印迹缓冲液相一致，防止凝胶溶胀或收缩。(2)将转移缓冲溶液冷却至4(3)制备纳滤膜和滤纸：戴乳胶手套切割纳滤膜和4张与凝胶大小相同的滤纸，用转移缓冲液浸泡纳滤膜和滤纸15分钟，直至无气泡。(4)将海绵充分浸泡在转移缓冲溶液中(5)打开蛋白转移罐的转移夹，依次放入：浸泡过的海绵、两张浸透转移缓冲液的滤纸、浸透转移缓冲液的胶水、纳滤膜、两

9、张浸透转移缓冲液的滤纸、浸泡过的海绵，然后关闭转移夹。将转移缓冲液倒入转移罐中，然后将转移夹放入罐中，使凝胶靠近负电极和正电极将转移罐放在4的冰箱中，在80毫安的恒定电流下进行4小时的电转移3蛋白质印迹分析(1)总蛋白在硝酸纤维素膜上的染色和脱色：电泳转移后取出硝酸纤维素膜，置于培养皿中。用丽春红S染色3分钟后，用铅笔轻轻标记标准蛋白带的位置，以计算特定蛋白的相对分子质量。然后，用丽春红S脱色液轻轻冲洗几次，直至红色消失。特异性抗体检测(1)将脱色后的纳滤膜放入培养皿中，加入封闭液，在水平摇床上继续摇匀，室温下封闭2小时以上。(阻断膜上不结合靶蛋白的区域，以防止一级抗体的结合)(2)倒出密封液

10、，加入冲洗液，在卧式摇床上不断摇动，每次冲洗膜3次，每次5分钟。(清除堵塞液体)(3)休息后在暗室中，将1份显影液和固定液分别放入塑料板中；在红光下取出x光胶片，并将其切割成合适的尺寸(比胶片的长度和宽度大1厘米)；打开x光胶片夹，将x光胶片放在胶片上，一旦放好，就不能移动，关闭x光胶片夹，开始计时；根据信号强度适当调整曝光时间，一般为1分钟或5分钟。曝光完成后，打开x光胶片夹，取出x光胶片，迅速浸入显影液中显影，出现明显条纹后立即停止显影。显影时间一般为1 2分钟(20 25)，当温度过低(低于16)时应适当延长显影时间；显影后，立即将x光胶片浸入定影溶液中，定影时间通常为5-10分钟，直到

11、胶片透明。用自来水冲洗残留的定影溶液，并在室温下干燥。有关注意事项(1)在适当的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解度和重复性；不同浓度的凝胶用于分离不同相对分子量的蛋白质(3)选择合适的表面活性剂和还原剂来破坏所有非共价结合的蛋白质复合物、共价键和二硫键；聚丙烯酰胺凝胶电泳只能测定多亚基蛋白质或含有多肽链的蛋白质的亚基或单肽链的相对分子质量。(4)尝试去除干扰分子，如核酸、多糖和脂质；(5)蛋白质样品应在低温下处理，以防止细胞破碎并释放各种酶来修饰它们。尽量使用新鲜的装载缓冲液。样品应与装载缓冲液均匀混合。不要反复冻融蛋白质，以免改变蛋白质的抗原特性。缓冲液必须溢出梳孔，否则你可能会发现蛋白质不

12、能流动。在电泳过程中，使用低电压流过浓缩凝胶，然后使用高电压流过分离凝胶，特别是对于感兴趣的高分子量蛋白质。硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜通过疏水作用与蛋白质结合，无需预先活化，对蛋白质活性影响不大；非特定背景颜色较浅；价格低廉，使用方便。然而，在洗涤过程中，结合到NC的小分子蛋白质很容易丢失。数控机床韧性差，容易损坏。聚偏氟乙烯(PVDF)膜：它与蛋白质有很高的亲和力。它需要在使用前浸泡在甲醇中，以激活膜上带正电荷的基团，使其更容易与带负电荷的蛋白质结合。但是价格稍微高一点。为了便于观察电泳效应和膜转移效应，以及判断蛋白质的分子量，应先将膜干燥，然后浸入20%的甲醇中，待完全浸泡后取出进行透光观

13、察，即可看到蛋白带(适用于聚偏氟乙烯膜)。传统的方法是用1Li春红染液对膜进行染色5分钟(在脱色摇床上摇匀)，然后冲洗掉没有被水染色的染液，看看膜上的蛋白质。从胶片转移后的所有步骤来看，必须注意胶片的保湿，避免胶片干燥，否则很容易产生较高的背景。背景高的可能原因：膜浸泡不均匀；膜或缓冲液污染；关闭不充分；抗体与封闭液的交叉反应；抗体浓度太高。解决方法是在转移膜之前，用100%甲醇完全浸泡膜。杂交前检测一级抗体和二级抗体；检测一级抗体、二级抗体和封闭液之间是否有交叉反应。根据所用预染色蛋白质的分子量标准，可以观察到膜转移的效果。通常，很难将所有1-2个分子量最大的带转移到膜上。膜转移的效果也可以

14、通过用李春红染色溶液对膜进行染色来观察。膜转移后的SDS-PAGE凝胶也可用考马斯亮蓝快速染色液染色，观察蛋白残留。影响蛋白质的定性分析，特别是对蛋白质纯度的检测和蛋白质分子量的测定，对目标蛋白质的特异性分析3.将10l PMSF(100毫米)加入1毫升裂解液中，摇匀并置于冰上。(在与裂解溶液混合之前，应充分摇动PMSF，直到它没有结晶。)4.向每瓶细胞中加入400 l含PMSF的裂解物，并在冰上裂解30分钟。为了充分溶解细胞，培养瓶应该经常来回摇动。5.裂解后，用干净的刮棒刮去培养瓶一侧的细胞(移动更快)，然后用枪将细胞碎片和裂解液移入1.5毫升离心管中。(整个操作应尽可能在冰上进行。)6.

15、在4下以12000转/分的速度离心5分钟。(通过提前打开离心机进行预冷)7、将离心后的上清液分装转移至离心管中，在-20保存(2)从组织中提取总蛋白：1.将少量组织块放入1 2ml的匀化器中，呈球形，用干净的剪刀尽可能多地将组织块剪成碎片。2.向均化器中加入400 l单一洗涤剂裂解液(包括PMSF)进行均化。然后把它放在冰上。3.研磨几分钟，然后放在冰上。重复研磨几次，尽可能多地研磨组织。4.裂解30分钟后，裂解液可以用移液管转移到1.5毫升离心管中，然后在4下以12000转/分钟的速度离心5分钟。取上清液，分装到0.5毫升离心管中，在-20保存。(3)从用药物处理的贴壁细胞中提取总蛋白：由于

16、药物的影响，一些细胞脱落。除操作(1)外，还应收集培养液中的细胞。从培养基中提取总细胞蛋白；1.将培养液倒入15毫升离心管中，以2500转/分钟的速度离心5分钟。2.弃去上清液，加入4毫升PBS，轻轻吹洗，然后以2500转/分的速度离心5分钟。弃去上清液，用PBS再次洗涤。3.用枪清洗上清液后，加入100 l裂解物(包括PMSF)并在冰上裂解30分钟。在裂解的过程中，经常弹一发子弹来完全裂解细胞。4.将溶胞产物与培养瓶中的溶胞产物混合，在4下以12000转/分的速度离心5min，取上清液，分装于0.5毫升离心管中，在-20下保存。(3)蛋白质含量的测定(1)制作标准曲线1.从-20取出1毫克/

17、毫升牛血清白蛋白，并在室温下熔化，以备后用。2.取18个1.5毫升离心管，3组，分别标记为0毫克、2.5毫克、5.0毫克、10.0毫克、20.0毫克和40.0毫克。3.根据下表向每个试管中添加各种试剂。0毫克2.5毫克5.0毫克10.0毫克20.0毫克40.0毫克1毫克/毫升牛血清白蛋白-2.5毫升5.0毫升10.0毫升20.0毫升40.0毫升0.15毫升/升氯化钠100毫升97.5毫升95.0毫升90.0毫升80.0毫升60.0毫升G250考马斯亮蓝溶液1ml1ml1ml1ml1ml1ml4.混合均匀后，室温放置2分钟。生物分光光度计的比色分析。(2)检测样品的蛋白质含量1.取若干个1.5毫升离心管，向每个离心管中加入