土壤微生物数量测定方法整理

1、土壤微生物的分离、鉴定和定量测定(1)培养基的制备一、测定总微生物的培养基：1.细菌培养基(牛肉膏蛋白胨琼脂培养基)牛肉膏5.0克蛋白胨10.0克氯化钠5.0克蒸馏水H20 1000m1琼脂15-20克酸碱度7.27.4准备步骤：(1)在一个100毫升的小烧杯中称取5.0克牛肉膏和10.0克蛋白胨，加入50毫升蒸馏水，置于电炉中，搅拌并加热至牛肉膏、蛋白胨完全溶解。在小铝锅中加入500毫升蒸馏水，将溶解的牛肉膏和蛋白胨倒入铝锅中，用自来水冲洗2 3次。加入5.0克1，在电炉上加热的同时搅拌。(3)加入清洗过的琼脂条，继续搅拌，加热至琼脂完全融化，并补充水至1000毫升。(4)用氢氧化钠或盐酸将

2、酸碱度调至7.0。用酸度计或玻璃棒接触少量液体，用精密的酸碱度试纸测量其酸碱度，用10%的氢氧化钠调至所需的酸碱度，必要时用滤纸或脱脂棉过滤。通常，它比所需的酸碱值高0.2，因为在高压灭菌后酸碱值通常会降低。5根据不同的需要，配制的培养基可分为试管或装有棉塞的三角瓶。重新包装时，注意避免将培养基挂在瓶口或管口造成杂菌污染。如液体培养基，应安装约1/4高度的试管；固体培养基中试管高度的约1/5；三角瓶的数量限制为三角瓶容量的一半。塞住棉塞，将其放入一个小铁丝筐中，然后用旧报纸包裹棉塞部分。标签标明培养基的名称、制备日期等。(6)高压灭菌，121灭菌30分钟，压力为0.1兆帕(15磅/平方英寸)。

3、2.放线菌培养基(改良高适1号琼脂培养基)20g可溶性淀粉硝酸钾1gK2HPO4 0.5g克硫酸镁7H2O 0.5g0.5g氯化钠0.5g硫酸亚铁7H2O 0.01g克pH 7.2-7.4准备步骤：(1)根据配方计算各种药物所需的量，然后分别称重。(2)称量并准确称量各种成分。(3)溶解准备时，先用少量冷水将淀粉搅拌成糊状，倒入少量沸水中，用火加热，边搅拌边逐一溶解其他成分，融化后，加水至1000毫升，调节酸碱度(可调节)。(4)分装、包装、灭菌。注：各组分按配方顺序溶解。对于微量成分，可预先配制高浓度溶液，便于控制配制的时间和量。在制备过程中，用少量冷水将淀粉混合成糊状，倒入少于所需水量的沸

4、水中，在火上加热，在搅拌的同时将其它组分逐一溶解。融化后，将水补充至1000毫升，并调节酸碱度。此外，在倾倒板之前，将铬酸钾溶液加入到熔化的培养基中，并且每300毫升培养基中加入1毫升(100 ppm)3%重铬酸钾。3.真菌培养基(马丁)-孟加拉红琼脂培养基)葡萄糖10.0克硫酸镁0.5g蛋白胨5.0g孟加拉红33.4毫克(或每升3.3毫升1%溶液)K2HPO4 1g蒸馏水H20 1000m1酸碱度是自然的(4-5)准备步骤：(1)根据配方计算各种药物所需的量，然后分别称重。(2)称量熔化：根据培养基的配方准确称量各组分，并在小于所需水量的条件下依次溶解各组分。在组分完全溶解后，加入组分并搅拌

5、以防止底部粘连，并补充水至所需体积。向1%溶液中加入孟加拉红，向1000毫升培养液中加入3.3毫升1%孟加拉红溶液。混合后，加入琼脂并加热至熔化。(3)分装、封堵、包装、灭菌。(4)由于链霉素在加热时容易分解，因此只有在培养基在临时使用过程中熔化后温度降至约45摄氏度时，才能添加链霉素。注：灭菌前加卡那霉素20g/ml，或倒盘前加链霉素。在倒盘前加入乳酸，每100毫升培养基加入0.1毫升。二。用于测定功能性细菌的培养基：1.亚硝酸盐细菌培养基(改良斯蒂芬森培养基A)(NH4)2SO4 2.0g磷酸氢钠0.25克硫酸锰0.01克硫酸镁0.03克硫酸钾0.75克碳酸钙5.0克蒸馏水1000毫升PH

6、 7.2注：最后加入碳酸钙，直接调节酸碱度，不溶解。该成分包含在培养基中以缓冲酸碱度。因为硝化细菌的生长会产生酸化效应，导致氢离子过量，硝化作用无法持续到一定程度，所以碱性物质应该用来平衡酸碱。下面也一样。2.硝酸细菌培养基(改良斯蒂芬森培养基B)磷酸氢钠0.25克硫酸钾0.75克硫酸镁0.03克硫酸锰0.01克CaCO3 1.0gNa2CO3 1.0g克纳米2 1.0克蒸馏水1000毫升PH 7.23.反硝化菌培养基柠檬酸钠5.0克硝酸钾2.0克磷酸二氢钾1.0克，K2HPO4 1.0克硫酸镁0.2克蒸馏水1000毫升酸碱度7.2-7.54.好氧固氮菌培养基(改良的阿什比无氮培养基)苯甲酸钠

7、1.5克K2HPO4 0.2克硫酸镁0.2克氯化钠0.2克0.1克硫酸钙酸碱度7.47.6注：当培养基装入试管时，在每个试管中加入1厘米长的滤纸条，以暴露液面。5.氨氧化细菌培养基(蛋白胨氨化培养基)K2HPO4 0.5克磷酸二氢钾0.5克，硫酸镁0.5克蛋白胨5.0克蒸馏水1000毫升酸碱度7.07.26.好氧纤维素分解菌培养基(imzhenitsky纤维素分解菌培养基)磷酸二氢钾1.0克FeCl36 H2O 0.1克硫酸镁0.3克氯化钙0.1克氯化钠0。1克纳米3 2.5克酸碱度7.27.4注意：当培养基被分别装入试管时，在每个试管中加入1厘米长的滤纸条，以暴露液面。(2)试剂的制备1.格

8、里斯试剂第一和第二流体：第一种溶液：将0.5克磺胺酸溶于150毫升20-30%的稀醋酸溶液中，储存在棕色瓶中。第二种液体：将0.5g-萘胺(-萘胺)加入50毫升蒸馏水中，煮沸，然后缓慢加入150毫升20-30%的稀醋酸溶液中，储存在棕色瓶中。2.纳氏试剂液体甲：将20.0克碘化汞和10.0克碘化钾溶于100毫升蒸馏水中。溶液B:将20.0克氢氧化钾溶于100毫升水中。分别配制甲液和乙液，冷却后混合，静置2天后使用。储存在棕色瓶子里。取上清液，储存三周，随着沉淀的增加，会影响测定结果。3.二苯胺试剂：将1.0g无色二苯胺溶于20毫升蒸馏水中，然后缓慢加入100毫升浓硫酸(相对密度1.84)，并储

9、存在棕色瓶中。(3)实验设备1.仪器和设备4冰箱、立式自动电加热压力蒸汽灭菌器、恒温培养箱、电子天平、电加热恒温水浴锅、洁净工作台、微量移液器、全温度空气振荡器、旋涡混合器、磁力搅拌器、微波炉等。2.设备准备(1)将90毫升水放入250毫升三角瓶中，装入15-20颗玻璃珠，灭菌。将9毫升水放入试管中灭菌。(3)试管架、1毫升无菌吸管、记号笔、白瓷遮光器、接种环、酒精灯等。(4)实验方法1.试样收集在靠近植物根系的部分，除去表层0-5厘米的表层土，收集5-20厘米的土壤剖面，多点收集，混匀后用四分法取1公斤，装回无菌塑料袋，4冰箱保存。2.悬浮液的制备称取10克土壤样品，放入盛有90毫升无菌水的

10、三角瓶中，置于摇床上，在室温下振荡20分钟。土壤样品与水充分混合，土壤中的微生物细胞完全分散并与土壤分离。这是10-1土壤悬浮液，用9毫升无菌水吸收1毫升，用无菌吸管吹吸3次，混合均匀，制成10-2土壤悬浮液。以此类推，依次制备10-3、10-4、10-5、10-6、10-7和10-8不同稀释度的土壤悬浮液。3.土壤悬浮物稀释度的选择(1)细菌333610-4 10-6放线菌：10-310-5(3)真菌：10-210-4以上采用稀释平板法，分别设置三个浓度梯度，重复两次。(4)亚硝酸盐细菌：10-310-6(5)硝酸细菌：10-310-66反硝化细菌：10-410-7(7)好氧固氮菌：10-3

11、10-6(8)氨氧化细菌：10-510-8(9)好氧纤维素分解菌：10-2-10-5以上采用最大似然法(MPN)，分别设置四个浓度梯度，重复三次。4.接种(平板接种技术)平板接种是用接种环将菌种连接到平板培养基上，或用移液管和滴管将一定体积的菌液转移到平板培养基上，然后进行培养。其目的是观察菌落形态，分离和纯化菌株，计数活菌株，或进行其他测试。有很多方法。根据不同实验目的的要求，可分为以下几种。(1)将倾斜应变连接到平板上划线方法：根据无菌操作方法，用接种环直接从斜面上取少量菌体。从左至右连续轻轻划线或切片平板培养基表面，注意不要切割培养基。或者，制备细菌悬液，在平板边缘的一个位置接种，燃烧并

12、消毒接种环，然后如上所述从有细菌的部分划线并接种。点连接法：一般用于接种霉菌菌落的观察。在无菌操作下，用接种针从斜面或孢子悬液中取出少量孢子，轻轻接触平板培养基。点连接位置和点数根据实验目的和要求确定。(2)将细菌悬液连接到平板上涂抹法：使用无菌移液管或滴管将一定体积的菌液吸到平板上，然后使用无菌玻璃涂抹棒将菌液均匀涂抹在整个平板上。混合菌法：首先将菌液加入培养皿中，然后加入固体培养基，使其融化并冷却至45 50，轻轻摇动，将其放平，待其完全凝固后，倒置培养。(3)将板应变连接到斜面该方法通常在无菌操作下将分离的单个菌落接种到斜面培养基上，以便进一步扩大培养或保存。接种前，选择平板上的单个菌落

13、并标记。左手拿着盘子，右手拿着接种环，在火焰上方或旁边操作。燃烧接种环后，将接种环放在空白培养基中冷却，以免烫伤细菌，然后挑出菌落，在火焰旁等待片刻。这时，左手放下平板，拿起斜面培养基，按照斜面接种法接种。5.培养将所有试管和平板置于25-28的黑暗条件下进行黑暗培养。培养时间从短到长如下：(1)真菌：2 3天；(2)细菌：3 4天；放线菌：5 7天。(4)氨氧化菌：7 8天；(5)好氧固氮菌：7 8天；(6)亚硝酸盐细菌：10 14天；(7)硝酸菌：10 14天；(8)反硝化细菌：10 14天；(9)好氧纤维素分解菌：10-14天；6.结果观察(1)亚硝酸盐细菌：取出5滴培养液，放在白瓷比色板上。分别加入两滴格里斯试剂的第一和第二溶液。如果亚硝酸盐存在，它会变红。(2)硝酸菌：取出5滴培养液，放在白瓷比色板上。分别加入两滴格里斯试剂的第一和第二溶液。如果它们不是红色的，这意味着亚硝酸盐已经完全消失了。此时，在白瓷比色板上再取5滴培养液，加入2滴二苯胺试剂。如果是蓝色，则表明亚硝酸已被氧化成硝酸，表明存在硝酸细菌。(3)反硝化细菌：加入格列斯亚硝酸试剂，观察颜色变化，确定阳性和阴性反应。(4)好氧固氮菌：观察试