基础生物学实验六实验手册

1、襄樊学院化学工程与食品科学学院生物系基础生物学实验6实验手册目录一、植物DNA的提取2二、琼脂糖凝胶电泳分离脱氧核糖核酸片段4三、聚合酶链反应扩增的脱氧核糖核酸片段6四、DNA片段回收及与载体8的连接大肠杆菌感受态细胞的制备和转化六、碱裂解法的少量质粒提取和质粒消化12七、细胞特异性染色15八。动物细胞的基本形态观察和细胞计数19九.细胞凝集反应和细胞膜通透性的观察X.线粒体和液泡的过度染色和观察26十一、聚乙二醇介导的细胞融合28十二。细胞骨架系统30的显示和观察十三。植物细胞有丝分裂染色体标本的制备和观察十四、蚕豆根尖微核检测技术36一、植物DNA的提取目的要求学习如何提取和纯化高等植物的

2、总DNA，并了解其原理。基本原则机械研磨通常用于粉碎植物组织和细胞。由于植物细胞匀浆中含有许多酶(尤其是氧化酶)，对DNA提取有不利影响，因此应在提取缓冲液中加入抗氧化剂或强还原剂(如巯基乙醇)，以降低这些酶的活性。在液氮中研磨可以很容易地打碎材料，并降低研磨过程中各种酶的作用。十二烷基硫酸钠(sarkosyl)、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和十二烷基硫酸钠(SDS)血浆表面活性剂能溶解细胞膜和核膜蛋白，解聚核蛋白和游离DNA。添加有机溶剂如苯酚和氯仿可以使蛋白质变性并分离提取物中的相。由于核酸(脱氧核糖核酸，核糖核酸)是高度水溶性的，细胞碎片和大多数蛋白质可以在离心后从提取物中去除。上清

3、液中加入无水乙醇沉淀DNA，沉淀后DNA溶于te溶液中，得到植物总DNA溶液。实验用品1.实验材料幼叶2.装备移液管、台式高速离心机、水浴盘、陶瓷研钵、1.5毫升离心管。3.毒品2% CTAB萃取缓冲液： CTAB 4g氯化钠16.364 g 1M Tris-HCl 20毫升(pH 8.0) 0.5M乙二胺四乙酸8毫升，首先用70毫升二水二乙酸溶解，然后以恒定体积灭菌至200毫升，并冷却至0.2-1% 2-巯基乙醇(400微升)3.24:1/氯仿：异戊醇4.红海母液5.其他试剂：异丙醇、TE缓冲溶液、无水乙醇和70%乙醇。方法步骤1.取冷冻或新鲜的植物材料，在液氮下研磨，然后转移到液氮预冷的1

4、.5毫升离心管中，加入500微升DNA提取缓冲液，每隔15分钟倒置于65水浴1小时；2.将其从水浴中取出，冷却至室温，加入500L 24:1氯仿：异戊醇，并将其倒置轻轻混合。3.以12，500转/分钟的速度离心5分钟，取上清液，加入500L 24:1氯仿：异戊醇，轻轻反转并上下混合。4.如果中间层蛋白质过多，重复步骤2；以12500转/分的速度离心5分钟，取上清液，加入2.5倍体积的无水乙醇，冷藏，在冰箱中沉淀30分钟；以6，12，500转/分钟的速度离心5分钟，弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀物，并以12，500转/分钟的速度收集沉淀物；7.干燥沉淀物，用50l含核糖核酸的碲溶解沉淀物；实验

5、结果实验报告二、琼脂糖凝胶电泳分离脱氧核糖核酸片段1目的要求学习水平琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。基本原则琼脂糖凝胶电泳是测定分子量、研究分子构象和分离纯化DNA分子片段的重要实验方法。当DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中游动时，它们受到电场和凝胶摩擦阻力的驱动。一般来说，每单位长度的双链DNA携带几乎相等的电荷，因此在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于凝胶的摩擦阻力，即DNA分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子量的对数成反比。不同长度的DNA片段由于迁移速度不同而被分开。脱氧核糖核酸乙基溴化物(EB)是一种荧光染料，在紫外光照射下能发出波长为590纳米的红色荧光。

6、DNA分子与EB形成荧光复合物后，EB发出的荧光比原始荧光增强了几十倍。它经常被用来观察凝胶中DNA条带的位置。实验用品1.实验材料从上次实验中提取的DNA2.装备刻度量筒、玻璃棒、三角烧瓶、移液枪和枪头、微波炉或沸水浴、凝胶填充板(由塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压和电流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。3.毒品琼脂糖凝胶(0.7-1.5%，琼脂糖粉末与1TAE混合)，TAE(三乙酸酯，乙二胺四乙酸)电泳缓冲液50浓缩储存溶液：242克三碱；57.1毫升；冰醋酸；0.5摩尔/升乙二胺四乙酸(pH8.0)，100毫升；加入600毫升蒸馏水，剧烈搅拌，加入蒸馏水至1000毫升，】。溴乙烷(EB)储

7、存液(10毫克/毫升):将1克EB加入100毫升水中，用磁力搅拌器搅拌数小时，然后转移到棕色瓶中，在4下储存(EB是一种强诱变剂，称重时应戴手套和口罩；如果接触到电子束，立即用大量水冲洗)。10样品添加缓冲液：0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青色ff，15% Ficoll水溶液，0.1mol/LNa2EDTA，pH8.0，1.0%SDS。方法步骤1.将琼脂糖电泳研磨工具放在水平台上。2.根据分离出的DNA片段大小，用电泳缓冲液配制适当浓度的琼脂糖溶液：准确称取琼脂糖干粉，加入装有定量电泳缓冲液的烧瓶或玻璃瓶中，用玻璃棒搅拌均匀，然后放入沸水浴或微波炉中加热至琼脂糖融化。3.凝胶稍微冷却后，将

8、胶水慢慢倒入模具中，胶水厚度宜为3 5毫米。4.室温下30 45分钟，让凝胶溶液完全凝固。当凝胶轻微凝结时，将其置于4的冰箱中，以大大缩短凝结时间。小心地拔出梳子，将凝胶放入电泳槽中，样品添加孔的一侧靠近阴极(黑色端)。5.将电泳缓冲液添加到电泳槽中，距离凝胶仅1毫米。6.取适量的DNA样品，与10个样品添加缓冲液混合，然后用移液枪将样品添加到样品孔中。7.添加样品后，关闭电泳槽盖并连接电极插头。脱氧核糖核酸应该侧向游向阳极(红色的塞子)。施加1-5V/cm的电压，其中该距离基于阳极和阴极之间的测量。如果电极插头连接正确，阳极和阴极将因电解而产生气泡。8.电泳时间的选择取决于凝胶长度、电压和D

9、NA片段大小。胶水越长，电压越低，DNA片段越大，所需时间越长。然而，当使用高压时，大的DNA片段的分辨率非常低，电泳带不清晰。9.当DNA样品在凝胶中迁移足够的距离后，关闭电源，取出样品，放入准备好的EB溶液中染色5 7分钟(EB被光分解，应放在暗室中)。在紫外线分析仪上观察并用数码相机拍照。实验结果实验报告三、聚合酶链反应扩增脱氧核糖核酸片段目的要求掌握聚合酶链反应实验的操作方法，了解其原理。基本原则与DNA的自然复制过程相似，它的特异性取决于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。聚合酶链反应由变性、退火(复性)和延伸三个基本反应步骤组成：模板核酸的变性：模板核酸加热到93左右一段时间后，由聚合

10、酶链反应扩增形成的双链模板核酸或双链核酸被解离成单链，以便与引物结合，为下一轮反应做准备；(2)模板DNA和引物的退火(复性):加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与单链模板DNA的互补序列配对结合；(3)引物延伸：在TaqDNA聚合酶作用下，以脱氧核糖核酸为反应原料，靶序列为模板，根据碱基配对和半保守复制的原理，通过重复循环变性-退火-延伸三个过程，可以合成一条与模板DNA链互补的新的半保守复制链，可以得到更多的“半保守复制链”，该新链可以作为下一个循环的模板。完成每个周期需要2-4分钟，扩增靶基因需要2-3小时，扩增倍数为几百万倍。实验用品1.实验材料从第一次实验中提取的DNA2.装备

11、聚合酶链反应仪、台式离心机、移液管、聚合酶链反应管、凝胶填充板(由塑料或玻璃制成)、凝胶样品梳、稳压和电流电泳仪、凝胶成像系统、电源等。3.毒品Taq酶，10x扩增缓冲液，dNTP，正向引物(10mol/l，溶于无菌水中，储存于-20)，反向引物(10mol/l，溶于无菌水中，储存于-20)，无菌水，50xTAE，EB，样品添加缓冲液。方法步骤1.向聚合酶链反应试管中加入适量的缓冲液、模板DNA、脱氧核糖核酸、正向引物、反向引物和Taq酶，将上述材料混合均匀，并通过短时间离心收集在试管底部。2.设置聚合酶链反应程序，将样品放入聚合酶链反应仪进行扩增。3.扩增后，用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。标

12、准聚合酶链反应系统_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _10X聚合酶链反应缓冲液5.0l10md NTP 1.0l正向引物1.0l反向引物1.0l模板2.0l聚合酶0.5微升ddH2O 39.5l_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _总体积50l实验结果实验报告4.DNA片段回收

13、和与载体的连接目的要求掌握DNA片段回收的方法和原理以及与载体的连接。基本原则质粒、噬菌体等进行酶消化和电泳；在对聚合酶链反应产物进行电泳后，通常需要回收和纯化一些用于亚克隆、探针标记等的DNA电泳片段。常用的DNA回收和纯化方法有粉碎法、低熔点琼脂糖法、冻融法等。还有现成的工具包。用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收DNA速度快，回收率高。其原理是将含有目标片段的琼脂糖融化后，将DNA吸附在硅基质材料上，同时去除蛋白质、其他有机化合物、无机盐离子、寡核苷酸等杂质。一些聚合酶链反应产物在3端具有突出的阻尼的特征，并在3端构建具有突出的dTMP的载体。常用的方法是先将带有某种限制性酶的载体消化成平头

14、，然后在70或72的反应体系中用Taq DNA聚合酶处理半小时，在该反应体系中只加入一种脱氧核糖核酸，即dTTP(也有报道称处理1-2小时可以提高克隆效率，因此加入T反应会更彻底)。加入T的反应也可以通过末端转移酶来完成。载体自连接和聚合酶链反应产物串联可以忽略。如果使用ddTTP，效果会更好。这种方法通常被称为T/A克隆，其效率是平头连接的50 100倍。实验用品1.实验材料上次实验的聚合酶链反应产物。2.工具台式高速离心机、低温水浴锅、水浴锅。3.毒品琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、T载体连接试剂盒、无水乙醇、无菌水。方法步骤1.小心地将含有要在紫外线灯下回收的DNA的凝胶切掉，放在1.5米的

15、地方2.加入3倍体积的溶胶溶液(每100毫克凝胶加入300微升QG缓冲液)，并将其置于50水浴中10分钟。在此期间，轻轻地连续上下转动离心管，以确保凝胶块完全溶解。如果回收的片段小于500bp或大于4kb，应加入异丙醇(100l异丙醇100mg凝胶)并混合均匀。3.将小柱放在2ml收集管上，并将上述溶液加入柱中。以13000rpm离心1分钟，弃去收集管中的液体，并将吸附柱放回收集管中。4.向吸附柱中加入700l缓冲液冲洗液，以13000转/分钟离心1分钟，弃去废液，将吸附柱放回收集管中。5.向吸附柱中加入500l冲洗液，以13000转/分钟离心1分钟，弃去废液。6.将离心吸附柱放回收集管中，以

16、13000转/分钟的速度离心2分钟，以尽可能多地去除冲洗液。在室温下打开吸附柱的盖子1-2分钟，并彻底干燥，以防止残留的冲洗液影响下一个实验。7.将吸附柱置于干净的离心管中，将50L 65-70的预热洗脱缓冲液滴入吸附膜中间的空气中，室温放置2分钟，以13000转/分钟离心2分钟，收集DNA溶液。取5l进行电泳检测。8.根据T型托架连接套件的说明，将回收的产品与T型托架连接起来。实验结果实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化目的要求掌握大肠杆菌制备和转化的原理，熟悉实验的具体操作步骤，掌握无菌操作技术。基本原则所谓的感受态是指一种生理状态，在这种状态下，受体细胞容易吸收外源性的DNA，这种外源性的DNA可以通过物理和化学方法诱导，也可以自然形成。诱导通常用于基因工程技术。用于转化的受体细胞通常是在限制-修饰系统(限制-修饰系统)中缺失的突变株，以防止引入的外源DNA的切割，用符号R-M-表示。基本原理是细菌在0的氯化钙低渗透溶液中会膨胀成球形，细胞膜的渗透性会发生变化。转化混合物中的质粒DNA形成耐脱氧核糖核酸酶的羟基磷酸钙复合物，并粘附在细胞表面。在42下经过短时间的热激处理后，细胞将被促进吸收DNA复合物。在丰富的培养基上生长数小时后，球形细胞将恢复并增殖