湖北省高校大学生生物实验技能大赛之生物化学实验培训方案

1、湖北省高等学校大学生生物实验竞赛生物化学实验培训方案根据竞赛精神，生物化学实验参赛的内容要求，具体安排以下培训内容。序号实验名称实验内容学时1洗涤玻璃器皿的洗涤42分光光度计使用紫外分光光度计使用方法可见分光光度计使用方法443常用玻璃仪器的使用移液管、烧杯、三角瓶、容量瓶、分液漏斗、滴定管等使用方法44主要仪器使用天平、酸度计、移液枪、离心机、干燥箱、干燥器、水浴锅、制冰机使用方法165溶液的配制和标定标准溶液、缓冲溶液、搅拌、震荡、混匀、定容方法86糖含量的测定a 3.5-二硝基水杨酸测还原糖（标准曲线的制作）b蒽酮比色法测糖含量（标准曲线的制作）c苯酚法测糖（标准曲线的制作）d多糖的测定

2、88887蛋白质含量的测定a斐林-酚试剂法测蛋白质（标准曲线的制作）b凯氏定氮法测定蛋白质含量c考马斯亮蓝G-250测蛋白质（标准曲线的制作）8868糖类的性质实验a- 萘酚反应间苯二酚反应糖类的还原作用层析22249蛋白质的性质实验双缩脲反应茚三酮反应黄色反应沉淀反应等电点层析22222410酶的动力学研究a尿酶的动力学研究b胰蛋白酶的动力学研究8811考试胰蛋白酶的动力学研究斐林-酚试剂法测蛋白质蒽酮测糖444实验一 玻璃器皿的洗涤1 实验目的和要求1.1 要求掌握生物化学实验中使用器皿洗净方法，保证实验的准确性；1.2内壁被水均匀润湿而无条纹、不挂水珠。2实验内容2.1 用去污粉、洗涤剂

3、洗实验室中常用的烧杯、锥形瓶、量筒等一般的玻璃器皿，可用毛刷蘸些去污粉或合成洗涤剂刷洗。去污粉是由碳酸钠、白土、细沙等混合而成的。将要刷洗的玻璃仪器先用少量水润湿，撒入少量去污粉，然后用毛刷擦洗。利用碳酸钠的碱性去除油污，细沙的磨擦作用和白土的吸附作用增强了对玻璃仪器的清洗效果。玻璃仪器经擦洗后，用自来水冲掉去污粉颗粒，然后用蒸馏水洗三次，去掉自来水中带来的钙、镁、铁、氯等离子。洗干净的仪器倒置时，仪器中存留的水可以完全流尽而仪器不留水珠和油花。出现水珠或油花的仪器应当重新洗涤。洗净的仪器不能用纸或抹布擦干，以免将脏物或纤维留在器壁上面沾污了仪器。仪器倒置时应放在干净的仪器架上（不能倒置于实验

4、台上）。锥形瓶、容量瓶等仪器可倒挂在漏斗板或铁架台上。小口颈的试管等可倒插在特别的干净的支架上。2.2 铬酸洗液滴定管、移液管、容量瓶等具有精确刻度的仪器，常用铬酸洗液浸泡15min左右，再用自来水冲净残留在器皿上的洗液，然后用蒸馏水润洗23次。铬酸洗液的配制：在台秤上称取10g工业纯K2Cr2O7（或Na2Cr2O7）置于500mL烧杯中，先用少许水溶解，在不断搅动下，慢慢注入200mL浓硫酸（工业纯），待K2Cr2O7全部溶解并冷却后，将其保存于带磨口的试剂瓶中。所配的铬酸洗液为暗红色液体。因浓硫酸易吸水，用后应将磨口玻璃塞子塞好。使用洗液应按以下顺序操作：2.2.1 用洗液洗涤前，凡能用

5、毛刷洗刷的仪器必须先用自来水和毛刷洗刷，倾尽水，以免洗液被稀释后降低洗涤效果。2.2.2 洗液用过后倒回原磨口瓶中，以备下次再用。当洗液变为绿色而失效时，可倒入废液桶中，绝不能倒入下水道，以免腐蚀金属管道。2.2.3 用洗液洗涤过的仪器，应先用自来水冲净，再以蒸馏水润洗内壁23次。2.2.4 洗液为强氧化剂，腐蚀性强，使用时特别注意不要溅在皮肤和衣服上。必须指出：洗液不是万能的，以为任何污垢都能用它洗去的说法是不对的。如被MnO2沾污的器皿，用洗液是无效的，此时可用草酸、盐酸或酸性Na2SO3等还原剂洗去污垢。23 用其它溶剂洗光度法中所用比色皿，是由光学玻璃制成的，不能用毛刷刷洗。通常视沾污

6、的情况，选用铬酸洗液、HCl-乙醇、合成洗涤剂等浸泡后，用自来水冲洗净，再用蒸馏水润洗23次。 2.3.1 NaOH KMnO4水溶液称取10g KMnO4放入250 mL烧杯中，加入少量水使之溶解，再慢慢加入100 mL 10% NaOH溶液，混匀即可使用。该混合液适用于洗涤油污及有机物。洗后在器皿中留下的MnO2nH2O沉淀物可用HClNaNO2混合液、酸性Na2SO3或热草酸溶液等洗去。2.3.2 KOH乙醇溶液适合于洗涤被油脂或某些有机物沾污的器皿。2.3.3 HNO3乙醇溶液适合于洗涤油脂或有机物沾污的酸式滴定管。使用时先在滴定管中加入3 mL乙醇，沿壁加入4 mL浓HNO3，盖住滴

7、定管管口，利用反应所产生的氧化氮洗涤滴定管。实验二 分光光度计的使用1 实验目的和要求掌握紫外光分光光度计、可见光分光光度计的使用2 实验内容可见-紫外光分光光度计的使用不同物质对不同波长入射光的吸收程度各不相同，从而形成特征性的吸收光谱。分光光度法不仅适应于可见光区，同时还可扩展至紫外光区及红外光区，因此给科研实验带来了极大方便。2.1接通稳压器电源，待稳压器输出电压稳定至200V后打开光度计电源，仪器自动进入初始化。2.2初始化约需时10min，内容包括：寻找零级光;建立基线;最后当显示器指示nm时，表明仪器完成初始化程序，可进入检测状态。2.3 按要求输入各项参数，选择相应比色杯(玻璃或

8、石英)，将空白管、标准管及待测管依次放入比色皿架内，关上比色池盖。2.4 以空白管自动调零。2.5试样槽依次移至样品位置，待数据显示稳定后按“START/STOP”键，打印机自动打印所测数据，重复上述步骤，直到所有样品检测完毕。2.6检测结束后应及时取出比色杯，并清洗干净放回原处，同时关上仪器电源开关及稳压器电源开关，做好使用情况登记。3 注意事项3.1仪器初次使用或使用较长时间(一般为一年)，需检查波长准确度，以确保检测结果的可靠性。3.2由于长途运输或室内搬运可能造成光源位置偏移，导致亮电流漂移增大。此时对光源位置进行调整，直至达到有关技术指标为止。若经调整校正后波长准确度、暗电源漂移及亮

9、电流漂移三项关键指标仍未符合要求，则应停止使用，并及时通知有关技术人员检修。3.3 每次检测结束后应检查比色池内有否溶液溢出，若有溢出应随时用滤纸吸干，以免引起测量误差或影响仪器使用寿命。3.4仪器每次使用完毕，应于灯室内放置数袋硅胶(或其它干燥剂)，以免反射镜受潮霉变或沾污，影响仪器使用，同时盖好防尘罩。3.5仪器室应通常保持洁净干燥，室温以5-35为宜，相对温度不得超过85%。有条件者应于室内配备空调机及除湿机，以确保仪器性能稳定。3.6仪器室不得存放酸、碱、挥发性或腐蚀性等物质，以免损坏仪器。3.7仪器长时间不用时，应定时通电预热，每周1次，每次30min，以保证仪器处于良好使用状态。3

10、.8坚持标准溶液现用现配，不使用过期标准液。3.9比色皿应该保持清洁，干燥。如有污物，可用稀盐酸清洗后，再用1：1的酒精与乙醚清洗凉干。禁止用硬物碰或擦透明表面。3.10在开机状态，不测量时，应该打开样品池门，否则，影响光电传感器寿命。3.11仪器使用完毕后盖好防尘罩。3.12比色皿的校准在440nm波长下，用含铬量30ug/mL 的重铬酸钾标准溶液进行检测。如果用两个比色皿。将两个比色皿都装上清水，以其中一个为基准，将另外一个比色皿（同样也是装清水的）作为待测样，记录其读数（或者用自动清零），把这一点作为你数据作图的第一点；然后用该比色皿装上样品进行正常监测。实验三 常用玻璃仪器的使用1 实

11、验目的和要求掌握玻璃仪器正确的使用方法2 实验内容移液管、烧杯、三角瓶、容量瓶、分液漏斗、滴定管等使用方法。实验四 主要仪器使用方法1 实验目的和要求掌握天平、酸度计、移液枪、离心机、干燥箱、干燥器、水浴锅、制冰机正确的使用方法2 实验内容2.1 天平的使用（电子天平的使用方法）2.1.1首先，水平调节水泡应位于水平仪中心。 接通电源，预热 30 分钟。 打开关 ON ，使显示器亮，并显示称量模式 0.0000g 称量 按 TAR 键 ，显示为零后。 将称量样品放入盘中央，待读数稳定后，该数字即为称物体的质量。 去皮称量 按 TAR 键清零，将空容器放在盘中央，按TAR键显示零，即去皮。将称量

12、样品放入空容器中，待读数稳定后，此时天平所示读数即为所称样品的质量。2.1.2 称量方法 直接称量法用来直接称量固体样品的质量。如小烧杯。要求：所称样品洁净、干燥，不易潮解、升华，并无腐蚀性。方法：天平零点调好以后，关闭天平，把被称样品用一干净的纸条套住 ( 也可采用戴专用手套 ) ，放在天平左盘中央。调整砝码使天平平衡，所得读数即为被称样品的质量。 固定质量称量法 用于称量指定质量的试样。如称量基准物质，来配制一定浓度和体积的标准溶液。要求：试样不吸水，在空气中性质稳定，颗粒细小（粉末）。 方法：先称出容器的质量，关闭天平。然后加入固定质量的砝码于右盘中，再用牛角勺将试样慢慢加入盛放试样的容

13、器中，半开天平进行称重。当所加试样与指定质量相差不到 10mg 时，完全打开天平，小心地将盛有试样的牛角勺伸向左边称量盘的容器上方约 23cm 处，勺的另一端顶在掌心上，用拇指、中指及掌心拿稳牛角勺，并用食指轻弹勺柄，将试样慢慢抖入容器中，直至天平平衡。此操作必须十分仔细。 递减称量法 用于称量一定质量范围的试样。适于称取多份易吸水、易氧化或易于和CO2 反应的物质。方法： 用小纸条夹住已干燥好的称量瓶，在用台秤上粗称其质量。 将稍多于需要量的试样用牛角匙加入称量瓶，在台秤上粗称。 将称量瓶放到天平左盘的中央，在右盘上加适量的砝码或圈码使之平衡，称出称量瓶及试样的准确质量（准确到 0.1mg）

14、，记下读数，设为 m1 g 。关闭天平，将右盘砝码或圈码减去需称量的最小值。将称量瓶从拿到接受器上方，右手用纸片夹住瓶盖柄，打开瓶盖。将瓶身慢慢向下倾斜，并用瓶盖轻轻敲击瓶口，使试样慢慢落入容器内（不要把试样撒在容器外）。如估计倾出的试样已接近所要求的质量时 ( 可从体积上估计 ) ，慢慢将称量瓶竖起，并用盖轻轻敲瓶口，使粘附在瓶口上部的试样落入瓶内，盖好瓶盖，将称量瓶放回天平左盘上称量。若左边重，则需重新敲击，若左边轻，则不能再敲。准确称取其质量，设此时质量为 m2 g 。则倒入接受器中的质量为 (m1m2 )g 。重复以上操作，可称取多份试样。2.2 酸度计的使用2.2.1 酸度计是对溶液

15、中的氢离子活度产生选择性响应的一种电化学传感器。 理论上，溶液的酸度可以这样测得：以参比电极、指示电极和溶液组成工作电池，测量出电池的电动势。用已知pH的标准缓冲溶液为基准，比较标准缓冲溶液所组成的电池的电动势，从而得出待测试液的pH值。因此酸度计也叫pH计2.2.2 组成酸度计由电极和电动势测量装置组成。 电极用来与试液组成工作电池；电动势测量部分对电池的电动势产生响应，显示出溶液的pH。 多数酸度计还兼有毫伏档，可以直接测电极电位。若配合适的离子选择电极，还可以测定溶液中某离子的活度（浓度）。实验室中广泛使用的pHS-3C型酸度计是一种精密数字显示酸度计。其测量范围宽，重复误差小。PHS-

16、3C型pH计由主机、复合电极组成。 pHS-3C型酸度计（上海雷磁）主机上有五个按钮，它们分别是：选择、定位、斜率、温度和确定按钮。 2.2.3 使用步骤2.2.3.1检查酸度计的接线是否完好。接通电源，按下背面的电源开关，预热30min后方可使用。2.2.3.2取下复合电极上的电极套，注意不要将电极套中的饱和KCl溶液撒出或倒掉。用蒸馏水冲洗电极头部，用滤纸吸干残留水份。 2.2.3.3定位在测量之前，首先对pH计进行校准，我们采用两点定位校准法，具体的步骤如下：a.打开电源开关，按“pH/mV”按钮，使仪器进入pH测量状态；b.用温度计测量被测溶液的温度，读数，例如25C。按“温度”旋钮至

17、测量值25C，然后按“确认”键，回到pH测量状态。c.调节斜率旋钮至最大值。d.打开电极套管，用蒸馏水冲洗电极头部，用吸水纸仔细将电极头部吸干，将复合电极放入pH为6.86的标准缓冲溶液，使溶液淹没电极头部的玻璃球，轻轻摇匀，待读数稳定后，按“定位”键，使显示值为该溶液25C时标准pH值6.86，然后按“确认”键，回到pH测量状态。e.将电极取出，洗净、吸干，放入pH为4.01的标准缓冲溶液中，摇匀，待读数稳定后，按“斜率”键，使显示值为该溶液25C时标准pH值4.01，按“确认”键，回到pH测量状态。f.取出电极，洗净、吸干。重复校正，直到两标准溶液的测量值与标准pH值基本相符为止。注：在当

18、日使用中只要仪器旋钮无变动则可不必重复标定。2.2.3.4 校正过程结束后，进入测量状态。用蒸馏水清洗电极，将复合电极放入盛有待测溶液的烧杯中，轻轻摇动，待读数稳定后，记录读数。完成测试后，移走溶液，用蒸馏水冲洗电极，吸干，套上套管，关闭电源，结束实验。2.3 移液枪的使用2.3.1移液枪的使用方法用拇指和食指旋转取液器上部的旋钮，使数字窗口出现所需容量体积的数字，在取液器下端插上一个塑料吸头，并旋紧以保证气密，然后四指并拢握住取液器上部，用拇指按住柱塞杆顶端的按钮，向下按到第一停点，将取液器的吸头插入待取的溶液中，缓慢松开按钮，吸上液体，并停留12秒钟（粘性大的溶液可加长停留时间），将吸头沿

19、器壁滑出容器，用吸水纸擦去吸头表面可能附着的液体，排液时吸头接触倾斜的器壁，先将按钮按到第一停点，停留一秒钟（粘性大的液体要加长停留时间），再按压到第二停点，吹出吸头尖部的剩余溶液，如果不便于用手取下吸头，可按下除吸头推杆，将吸头推入废物缸。2.3.2移液枪使用注意事项 (1)吸取液体时一定要缓慢平稳地松开拇指，绝不允许突然松开，以防将溶液吸入过快而冲入取液器内腐蚀柱塞而造成漏气。 (2)为获得较高的精度，吸头需预先吸取一次样品溶液，然后再正式移液，因为吸取血清蛋白质溶液或有机溶剂时，吸头内壁会残留一层“液膜”，造成排液量偏小而产生误差。 (3)浓度和粘度大的液体，会产生误差，为消除其误差的补

20、偿量，可由试验确定，补偿量可用调节旋钮改变读数窗的读数来进行设定。 (4)可用分析天平称量所取纯水的重量并进行计算的方法，来校正取液器，1ml蒸馏水20时重0.9982g。(5)移液器反复撞击吸头来上紧的方法是非常不可取的，长期操作会使内部零件松散而损坏移液器。 (6)移液器未装吸头时，切莫移液。 所设量程在移液器量程范围内不要将按钮旋出量程，否则会卡住机械装置，损坏了移液器。 数字清清楚楚在显示窗中， 旋转到所需量程 (7)在设置量程时，请注意 (8)移液器严禁吸取有强挥发性、强腐蚀性的液体（如浓酸、浓碱、有机物等）。 (9)严禁使用移液器吹打混匀液体。 (10)不要用大量程的移液器移取小体

21、积的液体，以免影响准确度。同时，如果需要移取量程范围以外较大量的液体，请使用移液管进行操作。2.4 冷冻离心机的使用低温分离技术是分子生物学研究中必不可少的手段。基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品的分离制备实验中都离不开低温离心技术，因此低温冷冻离心机成为分子生物学研究中必备的重要仪器。在国内，有多个厂家生产冷冻离心机，本实验室的高速冷冻离心机为GL-20G-型（上海安亭），落地式。配有角式转头：650ml、1210ml和121.5ml。极限转速20000rpm。2.4.1 安装与调试离心机应放置在水平坚固的地面上，应至少距离10cm以上且具有良好的通风环境中，周围空气应呈中性

22、，且无导电性灰尘、易燃气体和腐蚀性气体，环境温度应在030之间，相对湿度小于80%。试转前应先打开盖门，用手盘动转轴，轻巧灵活，无异常现象方可上所用的转头。转子准确到位后打开电源开关，然后用手按住门开关，再按运转键，转动后立即停止，并观察转轴的转向，若逆时针旋转即为正确，机器可投入使用。2.4.2操作程序 （1）插上电源，待机指示灯亮；打开电源开关，调速与定时系统的数码管显示的闪烁数字为机器工作转速的出厂设定，温控系统的数码管显示此时离心腔的温度。 （2）设定机器的工作参数，如工作温度，运转时间，工作转速等。 （3）将预先平衡好的样品放置于转头样品架上，关闭机盖。 （4）按控制面板的运转键，离

23、心机开始运转。在预先设定的加速时间内，其运速升 至预先设定的值。 （5）在预先设定的运转时间内（不包括减速时间），离心机开始减速，其转速在预先设定的减速时间内降至零。 （6）按控制面板上的停止键，数码管显示dedT，数秒钟后即显示闪烁的转速值，这时机器已准备好下一次工作。2.4.3 注意事项 （1）离心机应始终处于水平位置，外接电源系统的电压要匹配，并要求有良好的接地线，机器不使用，要拔掉电源插头。 （2）开机前应检查转头安装是否牢固，机腔中有无异物掉入。 （3）样品应预先平衡，使用离心筒离心时离心筒与样品应同时平衡。 （4）挥发性或腐蚀性液体离心时，应使用带盖的离心管，并确保液体不外漏以免腐

24、蚀机腔或造成事故。 （5）除工作温度、运转速度和运转时间外，不要随意更改机器的工作参数，以免影响机器性能。转速设定不得超过最高转速，以确保机器安全运转。（6）使用中如出现0.00或其它数字，机器不运转，应关机断电，10秒钟后重新开机，待所设转速显示后，再按运转键，机器将照常运转。 （7）不得在机器运转过程中或转子未停稳的情况下打开盖门，以免发生事故。 （8）每次操作完毕应做好使用情况记录，并定期对机器各项性能进行检修。2.5 干燥箱的使用方法电烘箱的种类很多，从家用食品电烘箱到工业用的烘房隧道烘箱等。原理与作用就是通过加热使水份蒸发及加热灭菌，或烘烤食品等。间单的说就是用可调可控的加热器在特定

25、的环境下对加热物品进行定时定温加热，家用食品电烘箱较简单。加热器一般由电热丝或电热石英管等发热。用定时器及可调温控开关可调或功率选择对加热进行控制。另一是超温保护，一般由弹跳式温控开关来完成。烘箱为可设定保持温度恒定，将湿的玻璃器皿烘干的大体积的容器。烘箱内的温度可以用前面板上的控制旋钮设定。烘箱内的温度可以用前面板上的控制旋钮设定。实际的温度可由附于其中的温度计直接读出。实际的温度可由附于其中的温度计直接读出。因为水的沸点为摄氏一百度，故一百度的温度必可使玻璃器皿很快烘干。因为水的沸点为摄氏一百度，故一百度的温度必可使玻璃器皿很快烘干。烘箱因为是由电力提供热能，而湿的物品是会导电的，故在使用

26、上宜小心不要有漏电的现象发生，故一般烘箱都要接地使用，以保安全。烘箱因为是由电力提供热能，而湿的物品是会导电的，故在使用上宜小心不要有漏电的现象发生，故一般烘箱都要接地使用，以保安全。若没有地线也要确认烘箱没有漏电的现象；若有轻微的漏电现象，可试着将插座拔起后将插脚以相反方向再插入，若没有漏电现象可小心使用，若仍有漏电现象则应立即停用。若没有地线也要确认烘箱没有漏电的现象；若有轻微的漏电现象，可试着将插座拔起后将插脚以相反方向再插入，若没有漏电现象可小心使用，若仍有漏电现象则应立即停用。2.6干燥器的使用方法干燥器有好几种，实验室最常用的干燥器就是一个比较大的玻璃容器，盖子是磨口的，可以密封，

27、容器的上部可以放要干燥的物品，下面一般是入“变色硅胶”(实验室常用的一种干燥剂)或无水氯化钙，一般是不放浓硫酸的，除特殊情况。因为如果万一有什么东西掉下去，可能会发生化学反应。中间是一块多孔的瓷板。这种干燥器不需要加温，只需更换干燥剂,变色硅胶还可以循环便用，如果颜色由绿色变成了浅红色，说明干燥剂失去了干燥作用，应把干燥剂放到恒温干燥箱中，在105-120度进行干燥，使它的颜色由浅红色变为绿色即可。我想你说的就是这种干燥器吧。2.7水浴锅的使用方法实验室常用的恒温设备有水浴锅和油浴锅，水浴锅的液体介质是水，沸点温度通常为100摄氏度。油浴锅的液体介质是油。用浴锅的目的是为了获得稳定的温度。在标

28、准环境下烧开水时，无论烧的火有多大，时间有多长，只要还有水在沸腾，它的温度一定是100度。这样，用水浴锅加热就可以控制一个恒定的温度。水浴锅主要适用于各大中院校、科研企事业单位的实验室和化验室，对各种化学样品，生物制品进行蒸馏、干燥、浓缩，是实验室不可缺少的实验器材。恒温水浴锅的使用方法，2.7.1 使用时必须先加适量的洁净自来水于锅内，也可按需要的温度加入热水，以缩短加热时间。2.7.2 接通电源，选择温度。数显表头，计数器最大位为十位数，按操作符号为增数，按操作符号为减数。红绿灯随体内温度的变化而转换。同样，绿灯是指示加热器工作，红灯为恒温。使用该仪器须经过加热、恒温两次以上才能达到正确的

29、温度精度。2.7.3 工作完毕，将温控旋钮、增减器置于最小值，切断电源。2.7.4 如果要锅内水温达100，作沸水蒸馏用时，可将调节旋钮调至终点。2.7.5加水不可太多，以免沸腾时水量溢出锅外，2.7.6锅内水量不可低于二分之一，不可使加热管露出水面。以免烧坏，造成漏水，漏电。2.7.7该产品使用时必须将三眼插座有效接地线.2.8 制冰机的使用方法2.8.1 开机 打开水源，将主电源开关置于ON（接通）位置，机器开始工作：机器设有延时装置，即在通电3分钟后启动减速器，压缩机等部件，在此期间指示冷凝温度高的红灯（LED）闪亮（即3分钟延时）。第一批雪花冰约在压缩机启动3分钟后落人储冰箱，10分钟

30、后出冰正常，产生坚硬的冰块。2.8.2 停机 关闭主电源开关，机器停止工作。每次重新启动时，机器都要经3分钟延时后开始自动运行。2.8.3 指示灯说明 电子雪花机的前面板上的五个指示灯分别监控下列情况：绿灯亮 机器在通电状态黄灯亮 储冰箱冰满，当冰被取走后10秒，机器自动恢复工作黄灯亮 水箱缺水，当来水后10秒，机器自动恢复工作红灯亮 冷凝器温度过高或环境温度过低红灯闪亮 开机时3分钟延时状态（正常）红灯亮 冰钻转向错误或转速低于850RPM红灯闪亮 蒸发器温度高：即开机10分钟后蒸发温度仍没降到-1以下。实验五 溶液的配制与标定1 实验目的和要求1.1 学会标准溶液、缓冲溶液的配制方法1.2

31、 学会搅拌、震荡、混匀、定容方法2 实验内容2.1 盐酸标准溶液的配制方法2.1.1仪器与试剂仪器：全自动电光分析天平 1台（1）称量瓶 1只（2）试剂瓶 1000ml 1个（3）锥形瓶 250ml 3个（4）酸式滴定管 50ml 1支（5）量筒 50mL 1只试剂：（1）0.1mol/L盐酸待标定溶液（2）无水碳酸钠（固基准物）（3）溴甲酚绿-甲基红混合指示剂2.1.2 步骤0.1mol/L盐酸标准溶液的标定步骤用称量瓶按递减称量法称取在270300灼烧至恒重的基准无水碳酸钠0.150.22g(称准至0.0002g)，放入250ml锥形瓶中，以50ml蒸馏水溶解，加溴甲酚绿-甲基红混合指示剂

32、10滴（或以25ml蒸馏水溶解，加甲基橙指示剂12滴），用0.1mol/L盐酸溶液滴定至溶液由绿色变为暗红色（或由黄色变为橙色），加热煮沸2分钟，冷却后继续滴定志溶液呈暗红色（或橙色）为 终点。平行测定3次，同时做空白实验。以上平行测定3次的 算术平均值为测定结果。2.1.3 计算式中： m基准无水碳酸钠的质量，g; V1盐酸溶液的用量，ml; V0空白试验中盐酸溶液的用量，ml;52.991/2 Na2CO3摩尔质量，g/molCHCL盐酸标准溶液的浓度，mol/L.2.2 氢氧化钠溶液的标定2.2.1 试剂（1）0.1000mol/L氢氧化钠待标定溶液（2）酚酞指示剂2.2.2 仪器（1）

33、全自动电光分析天平 1台（2）称量瓶 1只（3）碱式滴定管 （50mL） 1支（4）锥形瓶 （250mL） 3支（5）烧杯 （250mL） 2只（6）洗瓶 1只（7）量筒 （50mL） 1只2.2.3 测定步骤准确称取在110120准确称取在110120烘至恒重的基准邻苯二甲酸氢钾0.50.6g(称准至0.0002g)，放入250ml三角瓶中，加入250ml的蒸馏水溶解，加酚酞指示剂2滴，用0.1mol/LNaOH溶液滴定至由无色变为红色30秒不褪色为终点，平行测定3次，同时作空白试验。2.2.4 计算C(NaOH)=式中：m邻苯二甲酸氢钾的质量，gNaOH溶液的用量，ml空白试验NaOH溶液

34、的用量，ml204.22 邻苯二甲酸氢钾的摩尔质量，g/molNaOH标准溶液的浓度，mol/L2.3高锰酸钾溶液的标定2.3.1 仪器和试剂仪器（1）全自动电光分析天平 1台（2）称量瓶 1只（3）棕色酸式滴定管 50mL 1根（4）锥形瓶 250mL 3只（5）量筒 50mL 1只试剂（1）0.1mol/L高锰酸钾待标定溶液（2）草酸钠（基准试剂）（3）3mol/L的硫酸溶液2.3.2 步骤2.3.2.1 准确称取于105110烘干至恒重的基准试剂草酸钠0.180.22g（准确至0. 0002g），于锥形瓶中，加入50ml蒸水溶解后，再加入3mol/L的硫酸溶液15mL，加热到7585，趁

35、热用待标定的0.1mol/L高锰酸钾待标定溶液滴定至溶液呈粉红色，并保持30S不褪色，平行测定3次，同时做空白试验。2.3.2.2 结果计算式中：基准试剂草酸的质量，g； V1高锰酸钾标准溶液的消耗量，mL； V2空白试验高锰酸钾标准溶液的用量，mL； 67.00草酸钠的摩尔质量，g/mol/L； 高锰酸钾标准溶液的浓度，mol/L；2.2 实验室常用试剂、缓冲液的配制方法2.2.1 1 M Tris-HCl (pH7.4，7.6，8.0)组份浓度 1 M Tris-HCl，配制量 1L。配制方法：称量121.1 g Tris置于l L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，按下表

36、加入浓HCl量调节所需要的pH值。7.4约70 ml7.6约60 ml8.0约42ml将溶液定容至1 L，高温高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高l，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2.2.2 1.5 M Tris-HCl (pH8.8) 组份浓度 1.5 MTris-HCl，配制量 1 L。配制方法：称量181.7 g Tris置于1 L烧杯中，加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，用浓HCl调节pH值至8.8，将溶液定容至1 L，高温高压灭菌后，室温保存。注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为

37、Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高l，溶液的pH值大约降低0.03个单位。2.2.3 1 0TE Buffer (pH7.4, 7.6，8.0) 组份浓度 100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA，配制量 1 L。配制方法：量取下列溶液，置于l L烧杯中。1 M Tris-HCl Buffer(pH7.4，7.6，8.0)100 ml500 mM EDTA(pH8.0)20 ml向烧杯中加入约800 ml的去离子水，均匀混合，将溶液定容至1 L后，高温高压灭菌，室温保存。2.2.4 3 M醋酸钠(pH5.2) 组份浓度 3 M醋酸钠，配制量 100 ml。配制方法

38、：称量40.8 g NaOAc3H2O置于100200 ml烧杯中，加入约40 ml的去离子水搅拌溶解，加入冰醋酸调节pH值至5.2，加去离子水将溶液定容至100 ml，高温高压灭菌后，室温保存。2.2.5 PBS Buffer 组份浓度 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，10 mM Na2HPO4，2 mM KH2PO4，配制量 1 L配制方法：称量下列试剂，置于l L烧杯中。NaCl 8 gKCl 0.2 gNa2HPO41.42 gKH2PO40.27 g向烧杯中加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解，滴加浓HCl将pH值调节至7.4，然后加入去离子水将溶液定容至1 L，

39、高温高压灭菌后，室温保存。注意：上述PBS Buffer中无二价阳离子，如需要，可在配方中补充1 mM CaCl2和0.5 mM MgCl2。2.2.6 10 M醋酸铵 组份浓度 10 M醋酸铵，配制量 100 ml配制方法：称量77.1 g醋酸铵置于100200 ml烧杯中，加入约30 ml的去离子水搅拌溶解，加去离子水将溶液定容至100 ml，使用0.22 m滤膜过滤除菌，密封瓶，室温保存。注意：醋酸铵受热易分解，所以不能高温高压灭菌。2.2.7 Tris-HCl平衡苯酚 配制方法：使用原料：大多数市售液化苯酚是清亮无色的，无需重蒸馏便可用于分子生物学实验。但有些液化苯酚呈粉红色或黄色，应

40、避免使用。同时也应避免使用结晶苯酚，结晶苯酚必须，160对其进行重蒸馏除去诸如醌等氧化产物，这些氧化产物可引起磷酸二酯键的断裂或导致RNA和DNA的交联等。因此，苯酚的质量对DNA、RNA的提取极为重要，我们推荐使用高质量的苯酚进行分子生物学实验。操作注意：苯酚腐蚀性极强，并可引起严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜等。所有操作均应在通风橱中进行，与苯酚接触过的皮肤部位应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。苯酚平衡：因为在酸性pH条件下DNA分配于有机相，因此使用苯酚前必须对苯酚进行平衡使其pH值达到7.8以上，苯酚平衡操作方法如下：液化苯酚应贮存于-20，此时的苯酚呈结晶状态。从冰柜中取出

41、的苯酚首先在室温下放置使其达到室温，然后在68水浴中使苯酚充分融解。加入羟基喹啉(8-Qulnollnol)至终浓度0.1%。该化合物是一种还原剂、RNA酶的不完全抑制剂及金属离子的弱螯合剂，同时因其呈黄色，有助于方便识别有机相。加入等体积的1 M Tris-HCl(pH8.0)，使用磁力搅拌器搅拌l5min，静置使其充分分层后，除去上层水相。重复操作步骤。加入等体积的0.1 M Tris-HCl(pH8.0)。使用磁力搅拌器搅拌l5min，静置使其充分分层后，除去上层水相。重复操作步骤，稍微残留部分上层水相。使用pH试纸确认有机相的pH值大于7.8。将苯酚置于棕色玻璃瓶中4避光保存。2.3

42、搅拌、震荡、混匀、定容方法。实验六 糖含量的测定一 3.5-二硝基水杨酸测还原糖1 实验目的和要求掌握和学习3,5-二硝基水杨酸比色法还原糖含量的测定的基本方法2 实验内容2.1 原理3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖（各种单糖和麦芽糖）溶液共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内，还原糖的量和棕红色物的颜色深浅呈一定比例关系。在540nm波长下测定棕红色物质的消光度值，查标准曲线，便可求出样品中还原糖的含量。2.2 制作葡萄糖标准曲线取7支具有25mL刻度试管，编号，按表1所示的量，精确加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液和3,5-二硝基水杨酸试剂。表 各试管加溶液和试剂的量管号0123

43、456葡萄糖标准液(ml)00.20.40.60.81.01.2蒸馏水（ml）2.01.81.61.41.21.00.83,5-二硝基水杨酸试剂（ml）1.51.51.51.51.51.51.5相当葡萄糖量(mg)00.20.40.60.81.01.2将各管摇匀，在沸水浴中加热5min，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，再以蒸馏水定容至25mL刻度处，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀（如用大试管，则向每管加入21.5mL蒸馏水，混匀）。在540nm波长下，用0号管调零，分别读取16号管的消光值。以消光值为纵坐标，葡萄糖mg为横坐标，绘制标准曲线，求得直线方程。2.3 样品中还原糖的测定2.3

44、.1样品中还原糖的提取准确称取1.0g豆芽样品，加入10mL水，磨匀，转入离心管中，置于60恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。4000转/每分钟离心15min，上清液作为还原糖待测液。2.3.2 显色和比色取3支25mL刻度试管，编号，分别加入还原糖待测液1mL，3,5-二硝基水杨酸试剂1.5mL，其余操作均与制作标准曲线相同，测定各管的消光值。2.3.3结果处理分别在标准曲线上查出相应还原糖mg数，按下式计算还原糖百分含量：式中:C标准曲线方程求得的还原糖mg数； V提取液的体积（mL）； a显色时吸取样品液体积（mL）； W样品重（g）。二 蒽酮比色法测糖含量1 实验目的和要求掌握和

45、学习蒽酮比色法测定可溶性糖含量的基本方法2 实验内容2.1 原理植物在个体发育的各个时期，代谢活动也发生相应的变化，碳水化合物的代谢也不例外，其含量也随之发生变化。了解可溶性糖含量的变化，在生理上和实践上都有重要的意义。这里介绍的是蒽酮比色法，糖在硫酸的作用下生成糖醛，糖醛再与蒽酮作用，形成一种绿色的络合物，颜色的深浅与糖含量有关。方法简便，但没有志一性，对于绝大部分的碳水化合物都能与蒽酮反应，产生颜色。2.2仪器药品721型分光光度计、分析天平、研钵 、恒温水浴锅、烧杯、容量瓶、三角烧瓶、大试管、移液管 、漏斗、乙醚 、草酸钠、饱和醋酸铅。2.3 试剂葡萄糖标准溶液：称取已在80烘箱中烘至恒

46、重的葡萄糖100mg，配制成500ml溶液，即得每ml含糖为200g的标准溶液。蒽酮试剂：称取1g经过纯化的蒽酮，溶解于1000ml稀硫酸中即得。硫酸溶液由760ml浓硫酸（比重1.84)稀释成1000ml而成。 2.4 操作步骤2.4.1可溶性糖的提取称取重约5g的新鲜植物叶子，于研钵中乙醚少许，仔细研磨成均匀的浆状物，倒入烧杯中，用70热水洗涤研钵，洗液并入烧杯中，再加蒸镏水3040ml。将烧杯放在水浴锅中加热，保持温度7080约半小时，冷却后1滴1滴地加入饱和中性醋酸铅，以除去蛋白质，直至加入醋酸铅时不再形成白色沉淀为止。然后将此混合物连同残渣一并洗入100ml容量瓶中，加水至刻度，充分

47、振荡。以干燥漏斗将滤液过滤于一干燥的三角烧瓶中，瓶中事先放有少量（约0.20.4g）草酸钠粉末，以除去滤液中过量的醋酸铅，使生成草酸铅沉淀，再行过滤，所得的透明滤液即为可溶性糖提取液。2.4.2 显色及比色吸取上述糖提取液1ml，放入一干洁的试管中，加蒽酮试剂5ml混合之，于沸水浴中煮沸10分钟，取出冷却，然后于分光光度计上进行测定，波长为625nm，测得吸光度。从标准曲线上查得滤液中的糖含量（或经直线回归公式计算），然后再行计算样品中含糖百分数。2.4.3绘制标准曲线取标准葡萄糖溶液将其释成一系列不同浓度的溶液，浓度分别为每ml含糖0、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90

48、、100g。按上述方法分别测得其吸光度，然后绘制A026糖浓度曲线，或进行直线回归求得直线方程。2.4.4 计算式中：V为植物样品稀释后的体积(ml)C为提取液的含糖量(g/ml) W为植物组织鲜重(g)三 苯酚法测定可溶性糖1 实验目的和要求掌握和学习苯酚法测定糖含量的基本方法2 实验内容2.1实验原理植物体内的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。苯酚法测定可溶性糖的原理是：糖在浓硫酸作用下，脱水生成的糠醛或羟甲基糠醛能与苯酚缩合成一种橙红色化合物，在10100mg范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，且在485nm波长下有最大吸收峰，故可用比色法在此波长下测定。苯酚法可用于甲基化的糖

49、、戊糖和多聚糖的测定，方法简单，灵敏度高，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色稳定160min以上。2.2 实验仪器及试剂2.2.1 仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。2.2.2 试剂（1）90苯酚溶液：称取90g苯酚（AR），加蒸馏水10mL溶解，在室温下可保存数月。（2）9苯酚溶液：取3mL90苯酚溶液，加蒸馏水至30mL，现配现用。（3）浓硫酸（比重1.84）。（4）1蔗糖标准液：将分析纯蔗糖在80下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（5）100ug/L蔗糖

50、标准液：精确吸取1蔗糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。2.3 实验步骤2.3.1 标准曲线的制作取20mL刻度试管11支，从010分别编号，配制成0，10，20，30，40，50，60，80，100，150ug/ml 溶度各2ml的蔗糖溶液，然后按顺序向试管内加入1mL9苯酚溶液，摇匀，再从管液正面以520s（目的使蔗糖被硫酸充分氧化）。加入5mL浓硫酸，摇匀。比色液总体积为8mL，在恒温下放置30min。显色。然后以空白为参比，在485nm波长下比色测定，以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。2.3.2 可溶性糖的提取取新鲜植物叶片，擦净表面污物，剪

51、碎混匀，称取0.100.30g，共3份，分别放入3支螺口试管中，加入5-10mL蒸馏水，于沸水中提取30min，提取液过滤入25mL容量瓶中，反复冲洗试管及残渣，定容至刻度。2.3.3 测定吸取0.5mL样品液于试管中（重复2次），加蒸馏水1.5mL，同制作标准曲线的步骤，按顺序分别加入苯酚、浓硫酸溶液，显色并测定光密度。由标准线性方程求出糖的量。|2.3.4计算按下式计算测试样品中糖含量。可溶性糖含量（）从标准曲线查得糖的量（g）提取液体积（ml）稀释倍数/测定用样品液的体积(ml)样品重量(g)106100式中：C一标准方程求得糖量（ug）一吸取样品液体积（mL）V提取液量（mL）n一稀释

52、倍数W一组织重量（g）四 多糖的测定参照还原性糖、可溶性糖的测定方法进行实验七 蛋白质含量的测定一 斐林-酚试剂法测蛋白质1 实验目的和要求掌握和学习斐林-酚试剂法测蛋白质基本原理和方法2 实验内容2.1实验原理Lowry法是双缩脲法的发展，斐林(Folin)一酚试剂法结合了双缩豚试剂和酚试剂与蛋白质的反应，其中包括两步反应：第一步是在碱性条件下，与铜试剂作用生成蛋白质一铜络合物；第二步是此络合物将磷钥酸、磷钨酸试剂还原，生成磷铝蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关在650nm时比色测定的灵敏度比双缩豚法高100倍由于肽键显色效果增强，从而减少了因蛋白质种类引起的偏差该法适于微

53、量蛋白的测定（范围为5100ug蛋白质）2.2 实验材料、仪器及试剂2.2.1材料：新鲜的植物材料 2.2.2 仪器：722分光光度计、离心机、恒温水浴、定量加样器、冷凝回流装置一套、研钵、离心管、刻度移液管、微量滴定管、试管等2.2.3 试剂（1）0.5mol/L NaOH （2）斐林-酚试剂甲液：由A、B两种溶液组成： A液：4%碳酸钠溶液与0.2mol/L氢氧化钠溶液等体积混合； B液：1%硫酸铜溶液与2%的酒石酸钾钠溶液等体积混合； 使用前使用前将A与B按50：1的比例混合即成，此试剂只能在使用当天配制 （3）斐林一酚试剂乙液：称取钨酸钠100g，钥酸钠25g，加蒸馏水700mL溶解于

54、1500mL的圆底烧瓶中之后加入85的H3PO4 50mL，浓HCl 100mL，安上回流装置（使用磨口接头，若用软木塞或橡皮塞时，就必须用锡铂纸包起来），使其慢慢沸腾 10 h冷却后加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL，溴水23滴，打开瓶口煮沸15min，以逐出过量的溴，冷却后溶液呈黄色（若仍呈绿色，须再滴加几滴溴水，继续煮沸15min待冷却后稀释至l000mL，过滤入棕色瓶中保存使用时大约加水1倍，使最终浓度相当于1mol/L的酸度因此在使用前应进行标定标定方法：取5rnL斐林一酚试剂乙液放入锥形瓶内，用l mol/L标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞作指示剂，当溶液突然转红再转灰绿时，即为滴定终点计算其相当的酸度，用盐酸或氢氧化钠溶液调至相当于1mol/L的酸度 在测定时要注意，因为酚试