基因克隆与表达

1、蛋白原核表达,卫文强 2015.12,目的基因-T 表达载体 酶切， 胶回收，连接 转化到克隆用细胞（Top10) 提质粒，酶切验证 转化到表达用细胞（BL21（DE3)） 诱导表达 SDS-PAGE,DNA中的杂质如蛋白质、酚、氯仿、乙醇、SDS、EDTA等都会影响酶的活性。,1）. DNA的纯度,影响限制性内切酶活性的因素,2）. DNA的甲基化程度,dam甲基化酶（修饰GATC中的A）； dcm甲基化酶（修饰CCA/TGG的C）。,3）. 温度,不同的限制性内切酶的最适反应温度不同。大多数是37 oC，少数要求40-65 oC。,是影响限制酶活性的重要因素。,4）. 缓冲液(Buffer

2、),商品化的限制酶一般都带有专用缓冲液。,MgCl2、NaCl/KCl： 提供Mg2+和离子强度； Tris-HCl： 维持pH； 二硫苏糖醇（DTT）：保持酶稳定性； 牛血清白蛋白BSA等：有助于酶的稳定； 巯基乙醇：保持酶的稳定性，防止酶失活。,用时在冰上操作； 取酶用干燥、灭菌、新的枪头 酶用量不能超过酶切总体积的10%； 多种酶进行酶切时，先低盐后高盐缓冲液；,关心小贴士告诉你, 使用时注意事项：,连接、转化与重组子鉴定,1、连接,（1）必须是两条双链DNA。,（2）DNA 3 端有游离的-OH， 5端有一个磷酸基团（P）。,（3）需要能量,动物或噬菌体中：ATP 大肠杆菌中： NAD

3、+,（2）. 连接条件, ATP：反复冻熔，ATP活性降低，ATP溶解度不高，连接缓冲液宜分装； 单价离子：150-200mM NaCl，提高连接效果； PEG：5%以下可以提高连接效率,连接效果最好在37 ，但形成的互补不稳定; 最佳连接温度：12-16 ，较好的连接效果，互补又较稳定;,2）连接温度：,3）反应液中的成分：,目的或作用：,4）插入片段与载体的浓度比例,载体DNA与外源DNA的分子摩尔比通常为13左右，甚至110 或更高。,增加插入片段与载体的接触机会，减少载体自我连接的现象。,化学法（CaCl2法)：,转化原理：是Ca2+与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生

4、收缩作用，使细胞膜出现空隙，质粒或DNA重组分子便可进入细胞内（感受态细胞）。,2、转化,影响转化率的主要影响因素:, 载体本身的性质及其空间构象：超螺旋构象转化率最高；, 插入片段的大小：插入片段越大，转化效率越低；, 受体细胞的类型及预处理；, 转化方法：电击法高于化学法。, 限制性酶切图谱法,3、转化子的筛选和鉴定,质粒DNA的提取,质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。,质粒(Plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小从1-200kb不等，为双链、闭环的DNA分子，并以超螺旋状态存在于宿主细胞中。,质粒DNA提取方法：,碱裂解法、煮

5、沸法、 SDS法等, 碱裂解法原理：,在碱性条件下，双连DNA氢键断裂，结构破坏变性，环状超螺旋质粒不充分变性。在中性条件下变性质粒恢复原来构型，而线性大分子细菌DNA不能复性呈不溶物而经离心除去。, 抽提出质粒的构型：,1）超螺旋质粒DNA:在提取质粒过程中，超螺旋DNA占大部分。,2）开环质粒DNA：如果质粒DNA两条链中有一条链发生一处或多处断裂，分子就能旋转而消除链的张力，形成松驰型的环状分子，称开环DNA。,3）线状质粒DNA：如果质粒DNA的两条链在同一处断裂，则形成线状DNA。,抽提出的质粒三种构型电泳结果：,凝胶电泳技术,电泳目的：对核酸分子进行分离和检测, 凝胶分辨DNA的能

6、力：,凝胶浓度:, 浓度大，筛孔小，适合小分子电泳； 浓度小，筛孔大，适合大分子电泳,凝胶浓度的选择：取决于待检测的DNA的大小,原来如此！,电泳缓冲液, pH值：偏碱性，带负电荷, 离子浓度：离子浓度高 电流大 发热快胶溶解, 种类：,TAE （Tris+EDTA+醋酸）:电流大，易产生离子富集 TBE （Tris+ EDTA+硼酸）:缓冲能力最强 TPE （Tris+ EDTA+磷酸）:缓冲能力低 TNE （Tris+ EDTA+醋酸钠）,pET表达载体,pET表达载体的启动子是T7噬菌体基因10启动子（T7启动子），需要T7RNA聚合酶才能转录。 T7RNA聚合酶转录机制十分有效并具有选

7、择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；在非诱导条件下，几乎可以使目的基因完全处于沉默而不转录。 T7RNA聚合酶基因插入由大肠杆菌lacUV5启动子控制、DE3溶原状态下的大肠杆菌染色体上。,T7 表达系统 转录调控的机理 化学诱导型 噬菌体 DE3 是 l 噬菌体的衍生 株，一段含有 lacI、lacUV5 启 动子和 T7 RNA 聚合酶基因的 DNA 片段被插入其 int 基因中 用噬菌体 DE3 的溶源菌作为表 达载体的宿主菌，调控方式为 化学诱导型，类似于 Lac 表达 系统。,T7 RNA 聚合酶基因,lac 启动子,E.Coli （DE3）,IPTG 诱导,BL

8、21 :lon, ompT BL21(DE3) : T7 polymerase Rosetta: optimal codons Origami : thioredoxin reductase (trxB) , glutathione reductase (gor) Rosetta-gami Origami B: (IPTG concentration dependent),菌株种类,基本原理,SDS-PAGE技术是根据SDS能使蛋白质变性解聚成肽链并与肽链侧链以一定比例结合成SDS肽链复合体，从而掩盖了肽链本身所带电荷（SDS带负电），并消除了蛋白质分子间的形状差异，再结合PAGE技术（根据分子的形状、电荷、分子量综合差异来分离不同分子的技术）来分离不同分子量蛋白质或测定定蛋白质分子量的实验技术。,基本步骤,制备分离胶 制备浓缩胶 上样并电泳 凝胶板剥离与染色脱色 结果分析,加入分离胶溶液 pH 8.8,制备分离胶,封水的目的是使分离胶上表面平直，并排除气泡。 凝胶聚合好的标志是胶与水层之间形成清晰的界面。,分离胶 pH 8.8,制备浓缩胶,浓缩胶 pH 6.8,分离胶 pH 8.8,上样及电泳,开始电压恒定在80V，当进入分离胶后改为120V，溴酚蓝距凝胶边缘约5mm时，停止电泳。,凝胶板剥离与染色,电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶做好标记后放在大培养皿内，