实验四血清γ-球蛋白的提纯xxlppt课件

1、.,实验四 血清-球蛋白的提纯,生化教研室 徐先林,.,第三次实验报告总结,实验报告包括实验目的、原理、操作、结果、结论与讨论五部分。 原理写得不完整。 电泳及影响因素； 血清中蛋白质主要有5种，由于蛋白质具有两性解离，在pH=8.6缓冲溶液中，各蛋白质带负电荷，在电泳中向正极移动； 血清中各种蛋白质等电点和分子量不同，在同一电泳过程中运动速度不同而分离； 血清蛋白质能与氨基黑10B特异性结合而显现出蓝色，并将各条带剪下溶解于碱性溶液中，测定吸光度值则可以计算各蛋白相对含量。 实验结论与讨论（不要自问自答，不要分1、2、3.，不要重复原理，不要写思考题，不要写注意事项） 给出结论（注意样品是兔

2、血清，与人血清比较的话，需要说明人和兔血清含量可能有所差异。） 结合结果分析（1.膜条上各条带分离好不好？什么原因造成的？2.结果中各蛋白质百分含量，说明哪些原因可能会造成各蛋白百分含量偏离正常值？）错别字太多。,.,请同学们清洗自己小组以下用品,每个小组： 层析柱（1支） 比色板（2块） 玻璃棒（1支） 离心管 （1支） 滴管 （2支） 烧杯 （2个） 试管 （13支）,注意实验过程中每用一次清洗一次！,.,问题,1.血清蛋白质的分类？ 清蛋白、1球蛋白、 2球蛋白、 球蛋白、 球蛋白 2.分离纯化蛋白质的方法？ 电泳、透析及超滤、有机溶剂沉淀、盐析、免疫沉淀、层析、超速离心法等 3.盐析？

3、层析？透析？ 加入中性盐破坏蛋白质稳定因素而使其沉淀（水化膜和电荷层） 利用各组分理化性质不同而分离（本实验是利用组分分子大小不同而分离） 半透膜把大小分子分开 4.本实验盐析所用硫酸铵饱和度是多少？ 33% 5.定性检测蛋白质和铵根离子的方法？ 缩二脲反应（紫红色） 或者 与磺柳酸反应生成白色沉淀 纳氏试剂（黄色或棕色）,.,一.实验目的,1.掌握蛋白质分离纯化方法； 2.掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白质 的基本原理； 3.熟悉离心机的操作； 4.熟悉蛋白质、NH4+定性检测的方法。,.,分离纯化蛋白质的方法,沉淀法,层析法,电学法,离心,膜分离技术,透析 超滤,.,二.实验原理,本

4、实验是应用相同浓度的硫酸铵反复盐析分离血清中的-球蛋白，再利用凝胶层析法除盐，即可得到比较纯的-球蛋白。 采用盐析法分离清蛋白（主要是清蛋白），再用透析方法除去小分子物质。,.,二.实验原理,（一）盐析（salting-out） 定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳定因素并使其从溶液中沉淀析出的现象。 原理: 破坏蛋白质两个稳定因素：水化膜和电荷层 中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 优点：蛋白质不变性，常用方法。,.,二.实验原理,（二）透析（dialysis） 定义：利用半透膜把大小分子分开。 透析法是利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，而大分子物质不能通过半透膜的性质

5、，达到分离的方法。 其利用半透膜原理，通过扩散、对流体内各种有害以及多余的代谢废物和过多的电解质移出体外，达到净化血液的目的，并且达到纠正水电解质及酸碱平衡的目的。,临床应用：血液透析,.,二.实验原理,（三）层析（chromatography） 层析技术是利用混合物中各组分物理化学性质（如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等）的差别，使各组分在支持物上集中分布在不同区域，借此将各组分分离。 按层析的原理不同可以分为：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶层析和亲和层析。（教程P25） 凝胶是一类具有三维空间多孔网状结构的物质（分子大小不同） 小分子进入凝胶颗粒的微孔中，流

6、程长，下移速度慢；大分子不能进入凝胶颗粒的微孔中去，只能分布在颗粒的间隙中，所以流程短，向下移动速度快。,.,二.实验原理,凝胶层析法（根据分子大小差异而分离）,.,二.实验原理,（四）离心（centrifuge） 离心技术是利用离心力，依据物质的沉降系数、扩散系数和浮力密度差异而进行物质的分离、浓缩和分析的一种技术。,.,二.实验原理,离心操作要领 1、根据待离心的溶液性质及体积选择合适的离心管。装载液体时要按各种离心机操作说明进行。无盖离心管不能装的太满。密封的或有盖离心管常要求装满，以免离心管变形。 2、检查离心管套筒是否完好、套筒内有没有软胶垫或棉花。 3、精确地平衡离心管及其内容物（

7、配平）。 4、平衡后的离心管和内容物（包括套筒）应对称放置。 5、启动离心时离心速度由慢到快。,.,二.实验原理,（五）检测蛋白质、 NH4+的方法 检测蛋白质 缩二脲试剂：溶液显紫红色 20磺柳酸 ：有白色沉淀产生 检测NH4+ 纳氏试剂：黄色或棕色,.,三.实验操作,1、盐 析 2、透 析 3、层 析（脱盐） 4、检 测,.,1、盐析,取离心管一支加入血清2ml,加入2ml PBS，摇匀,逐滴加入pH7.2饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀,上清液（主要含清蛋白）倾入试管中,静置10分钟，再离心（2000转/分）10分钟,沉淀用1ml PBS搅拌溶解,逐滴加饱和(NH4)2SO4 0.5

8、ml,摇匀,倾弃上清液（主要含、球蛋白）,沉淀即为初步纯化的球蛋白,透 析,脱 盐,静置10分钟，再离心（2000转/分）10分钟,用于配平,用于配平,样品为猪血清,.,2、透析,清蛋白,换 水,透析袋刚放入水中时,立即取袋外液体检查有无NH4； 每隔4分钟检查一次，共3次，比较NH4透出的情况。,约0.5小时，检查袋外液体的NH4情况； 取袋外液2滴，置于小试管中，然后滴加20磺柳酸12滴，观察有无沉淀产生。,水,水,.,3、层析,1 2 3 4 5 6 7 8 9 10,上样 球蛋白，PBS 10滴溶解,装柱 装柱前用滤纸片堵住层析柱下口，防止下端玻纱堵塞 葡聚糖凝胶G25，柱 高3/42

9、/3柱长,流速：每分钟10滴左右,加入洗脱剂 PBS 10ml,收集 20滴换一支试管,., 层析后洗脱液检测 每组两块比色板,洗净备用。 一块在各孔滴加纳氏试剂（检测NH4+）,另一块滴加缩二脲试剂（检测蛋白质）。若发现有显色反应此孔显色剂弃用。 检测蛋白及铵根离子不用滴管,避免污染,直接用试管倾倒。 用“-”表示无现象，用“+”, “+”, “+”等表示颜色深浅。 回收凝胶,.,四.实验结果(用+ -号表示，不写颜色),表1. 层析后洗脱液的显色结果,表2. 透析后的袋外溶液显色结果,检测人： 时间：,检测人： 时间：,.,五.注意事项,.正确使用离心机。 .装柱时检查层析柱下端是否有滤纸

10、片，是否漏水。 .装柱后凝胶均一、无断层，无气泡，柱床面平整。 .柱床面保持有缓冲液。 .层析加样时动作缓慢轻柔，不要破坏柱床面的平整。 .每用一次滴管，请用水清洗干净，防止试剂及被测样 品交叉污染。 7.两人一组，分工协作。,.,思考,1.为什么硫酸铵能够使蛋白质沉淀？ 2.本实验盐析所用盐的饱和度是多少？ 为什么能够沉淀-球蛋白？ 3.如何证明分离纯化的样品是何种蛋白质？ 4.两步盐析之后，沉淀中含有哪些物质？ 5.层析结果好坏的判断标准是什么？ 6.透析时，烧杯中出现蛋白质说明什么问题？,.,预习,实验五 细胞核的分离与核酸的鉴定,1.核酸的基本组成 2.DNA和RNA结构及分布区域 3.核酸理化性质 4.实验原理及操作 5.实验中采用了几种离心方法,.,教学大纲,一 教学目的 学习综合利用盐析、凝胶层析、透析等多种实验 技术对蛋白质进行分离纯化的方法。 二 教学要求 （一） 掌握盐析、凝胶层析、透析法分离纯化蛋白