NGS测序技术与分析流程图

1、.,第一代测序技术,Sanger测序,1977年，桑格测定了第一个基因组序列，是噬菌体X174的，全长5375个碱基,.,Sanger法核心原理是：由于ddNTP的2和3都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，因此可以用来中断DNA合成反应，在4个DNA合成反应体系中分别加入一定比例带有放射性同位素标记的ddNTP（分为：ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列,.,新一代测序介绍,三大测序平台的前世今生,Lynx MPSS,Solexa,ABI SOLiD,454,Ion Torrent,Helic

2、os,SMRT,Illumina Solexa,Roche 454,Polony Seq,ABI Ion Torrent,Pacific Biosciences,.,Roche-454,454公司可谓新一代测序技术的奠基人。2005年底，454公司推出了革命性的基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序系统Genome Sequencer 20 System，被Nature杂志以里程碑事件报道，开创了边合成边测序（sequencing-by-synthesis）的先河。之后，454公司被罗氏诊断公司以1.55亿美元收购。 454测序原理,.,测序实验流程：,1、文库制备：根据样品的种类和实验目的，将

3、基因组DNA/cDNA片段化处理至400-800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后变性处理回收单链的DNA（sstDNA）；然后和两个44个碱基长的衔接子（adaptor）A、B进行平端连接。A、B 衔接子各自含有20个碱基的PCR 引物序列、20个碱基的测序引物序列和4个碱基的对照序列（TACG），除此之外，B衔接子的5端还标记有一个生物素基团，供后续的分离合适的测序模板使用。,.,测序实验流程：,2、Emulsion PCR：特定比例的单链DNA文库被固定在特别设计的DNA捕获磁珠上，使大部分磁珠磁珠携带了一个独特的单链DNA片断。磁珠结合的文库被扩增试剂乳化，形成油包水的混合物，

4、每个独特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，而不受其他的竞争性或者污染性序列的影响。整个片段文库的扩增平行进行。扩增后产生了几百万个相同的拷贝。随后，乳液混合物被打破，扩增后仍结合在磁珠上的片段既可被回收纯化用于后续的测序实验；,.,测序实验流程：,3、测序反应：携带DNA的珠子与其他反应物混合物，随后放入PTP板中进行后继的测序。 PTP孔的直径（29um）只能容纳一个珠子（20um）。然后将PTP板放置在GS FLX中，测序开始。每一个与模板链互补的核苷酸的添加都会产生化学发光的信号，并被CCD照相机所捕获；,.,测序实验流程：,4、数据分析：GS FLX系统在10小时的运行当中可获得

5、100多万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息，通过GS FLX系统提供两种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析。,.,454 Pyrosequencing,.,.,454 的特点与主要应用,读长较长，400600bp 通量较低，1Run 1M 序列，400600Mb 相对成本较高 主要应用：de novo测序,.,Illumina solexa,Solexa 测序原理,.,Illumina solexa,.,Illumina Solexa 桥式PCR,diol,diol,1st cycle denaturation,.,Illumina Solexa Base Calling,.,Solex

6、a 的特点与主要应用,读长较短，100150bp 通量高，25G每天，120-150G每Run 主要应用：RNA测序、表观遗传学研究,.,ABI SOLiD,SOLiD Sequencing by Oligo Ligation/Detection Oligo连接测序：通过连接酶连接，再对oligo上荧光基团进行检测,SOLiD 5500 xl,.,ABI SOLiD测序前期制备,A 样品片段化 磁珠连接,B 乳化PCR 3末端修饰,C 磁珠富集 转到测序玻片,.,ABI SOLiD测序原理,.,ABI SOLiD荧光结合和结果示例,SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3

7、length=35 T11.0203.3.1113211010332111302330201 +SRR029969.1 VAB_5551_12_381_F3 length=35 !36!8/8:!:!4626=(8.)43),(95,A. SOLiD Oligo荧光基团模式图,B. SOLiD 测序结果示例（Color Space),.,.,SOLiD 的特点与主要应用,读长较短，50-75bp 精度高，可达Q40 通量高， 20-30G每天，1Run 可达120G 主要应用：基因组重测序、SNP检测等,.,Ion torrent,Ion Torrent 测序原理,.,精度,Examples:

8、 90% condence (10% error rate) = Q10 99% condence (1% error rate) = Q20 99.9% condence (.1% error rate) = Q30,.,三种平台的技术差异,.,三种平台的效能参数差异,.,转录组测序测序流程,.,转录组主要分析内容,.,小RNA测序,.,果蝇三种组织中MiRNA表达情况,.,MiRNA表达模式分析,.,新miRNA预测,.,miRNA编辑情况分析与统计,.,分析软件介绍,质量控制软件 (Quality Control) 定位软件 (Mapping the reads) 已知基因（差异）表达评估软件 (Differential Expression) 新基因鉴定软件 (New gene identification) 可视化展示软件 (Virsulization) 基因功能注释软件 (GO term or KEGG pathway analysis),.,数据格式示例,Fastq 格式,Color Space 格式,.,Phred score,.,质量控制,.,利用galaxy进行原始数据处理,/,.,Galaxy History VGN FASTQ,https:/main.g2.bx.ps