胎盘间充质干细胞的分离和培养 2016

1、胎盘间充质干细胞的分离、原代和传代培养及鉴定油井2016.7.21目录序言21分离制备PMSC组织选择32脐带、胎盘MSC的分离纯化52.1胎盘组织的获取、储存和清洁52-2脐带、胎盘MSC的分离纯化方法63原代培养和传代培养103-1徽章103-2培养密度113-3培养条件113-4交换113-5继代培养123-6细胞形态和生长速度123-7 MSC的冷冻存储和恢复：124细胞表面抗原检测135增长曲线136细胞周期137分化可能性13参考文献13附件1其他实验室从脐带血、脐带、胎盘等各个组织分离MSC的方法15脐血15脐带15羊膜17绒毛18淘汰层18胎盘19全灌注方法20附件2背景知识2

2、0附件3 PMSC实验所需试剂21序言干细胞(Stem cell，SC)是可以自我再生、不分化，分化为两个或更多不同系统的细胞。在特定条件下，干细胞可以分化成多种成熟的细胞类型。干细胞根据来源和分化潜能，可分为胚胎干细胞(Embryonic stem cell，ESC)和成体干细胞(Adult stem cell，ASC)两类。胚胎干细胞来自早期囊胚和胚胎内层的细胞群，具有分化为3个胚胎细胞的能力。但是胚胎干细胞应用时产生的免疫排斥、体内实验中肿瘤形成、相关伦理问题等影响限制了临床应用。早期研究表明成体干细胞在原生胚胎形成后在胎儿和成体组织中形成，成体干细胞主要分化为其来源组织的细胞类型。但是

3、最近几年，研究结果表明，成体干细胞有分化为除来源以外的其他胚叶组织的能力。间充质干细胞也称为间质干细胞，属于最先从骨髓分离的成体干细胞。MSC不是早期中胚层发育的造血，而是成体干细胞，可以在体外贴在墙上，表示纺锤形。细胞质丰富，细胞核圆，细胞核1-3个。在适当的条件下，可以大量扩增，转化为重虫祖细胞，分化为包含脂肪和骨、软骨、内皮细胞、纤维细胞等3个胚胎的多种组织细胞。MSC的免疫原性低，可转移到肿瘤，具有免疫调节和造血支持等功能，是容易表达外来基因，对基因治疗至关重要的载体细胞。一些研究人员还发现，MSC在混合淋巴细胞中起着抑制t淋巴细胞免疫反应的类似免疫抑制剂的作用，同时抑制t细胞的同种增

4、殖反应。因此，MSC在治疗组织缺损、长期退行性疾病、肿瘤、免疫疾病方面具有相当大的应用前景。近年来，MSC在干细胞研究中逐渐成为热点(张慧燕等，2014年)。目前报告的间充质干细胞主要来源于骨髓，用密度梯度离心法得到。分离方法很简单，但捐赠者要采集骨髓，就需要进行比较痛苦的手术，提取过程和提取后感染的可能性很高。人类骨髓间充质干细胞的含量很低，每105-106个就只有1个左右的核细胞。而且随着年龄的增长，骨髓间充质干细胞的数量、增殖和分化能力明显减少，受到研究和应用的限制，尤其是临床应用。动员的外周血、乳牙、脐带、脐带血等其他组织也有间充质干细胞，但这些组织获得的细胞数量比较有限。所有这些因素

5、都限制了间充质干细胞在组织工程和临床中的使用。研究结果表明，目前胎盘或脐带属于临床废弃物，容易获得，没有污染，研究和应用的基本无伦理争议，胎盘或脐带包含丰富的MSC。研究结果表明，PMSC比骨髓间充质干细胞更容易分离培养，细胞活性更好，可分化为脂肪、成骨等多种细胞。此外，这些胎盘原的间充质干细胞(placenta-derived mesenchymal stem cells，PMSCs)具有很低的免疫原性，大部分患者对胎盘或脐带间充质干细胞具有天然免疫耐受力，人胎盘间充质干细胞在研究相关疾病的动物模型中也是人-胎间充质干细胞目前MSC主要用于抑制移植物对宿主反应。动物模型研究结果PMSC对子宫

6、内膜损伤(刘方，2013年)、大鼠肝组织损伤(宫凌晨等，2011年)、APP转基因大鼠阿尔茨海默病(郭亚南等，2009年)有疗效，组织工程皮肤(西维亚等，2013年)因此，将胎盘和脐带作为中间充质干细胞的新来源综合利用，优化分离纯化和继代培养条件，加快细胞繁殖，降低培养成本，高效确保大量PMSC，对多种疾病实验研究及医院各部门的临床应用也具有重要意义。1分离制备PMSC组织选择胎盘始于胚胎发育胚胎外胚层，足月分娩的胎盘由羊膜、绒毛膜和蜕膜层组成。在脐带血中(海洋细等，2009；观电影等，2011)，脐带(徐妍等，2009；寒流等，2012；观影等，2011年；李彦奇等人，2014年；赵霖等，2

7、016)，整个胎盘(陆缘等，2009；谢文琼等，2010年；欧阳等，2015年；赖平等，2016)，胎盘羊膜层(宫黎明等，2011；徐彪等，2013年；张慧娟等，2014年；系列等，2015，绒毛层(红岩等，2014；有关于寒流等2012)和淘汰(寒流等，2013)分离培养MSC的报道。现在大部分研究者将胎盘小叶(包括绒毛和绒毛营养层)分离出来(红燕等，2014年)。胎盘的细胞成分由滋养膜细胞和间质细胞、血管内皮细胞和Hofbauer细胞(纱门琼等，2010年)组成。从胎盘组织中分离MSC准备时，其他细胞干扰(苗宗宁等，2009)不可避免，其中最大数量的血细胞干扰占主导地位。选择MSC分离组织

8、时，要考虑的组织中可能包含最多MSC的部分，并尽可能减少其他种类的细胞干扰以获得纯度高、活力强的MSC。关于人类脐带血来源的MSC (human umbilical cord blood MSC，huc b-MSC)的存在和继代扩增是否稳定，存在争议。之后实验确认脐带血中有MSC，脐带血来源MSC和骨髓来源MSC具有相同的生物学特性和功能特性(haiwei等，2009)。但是脐带血中也有多能性体干燥/祖细胞，分离重虫源干细胞的过程以失去造血干细胞为标准，个体差异很大(徐延等，2009年)。脐带是一根静脉和两条动脉，周围是沃顿 s Jelly，外层是羊膜来源的上皮，在发育方面脐带是干细胞形成和通

9、过的途径(观电影等，2011)。其他研究机构从人类脐带组织分离为人力umbilical cord MSC(huc-MSC)。由于人脐带的结缔组织是间充质干细胞的丰富组织来源(徐延等，2009年)，hUC-MSC一般会剥离脐带动静脉和外皮。观电影等(2011)比较了脐带血和脐带的MSC原代培养过程。结果表明，脐带血的细胞成分复杂，在初级培养中，发现了更多的纤维质和大圆形破骨等两种形态的附着细胞，交换液和系杆破骨等细胞逐渐减少消失，留下了更单一形态的漩涡等细胞集合体。脐带源中培养的附着细胞不会随着交换液而丢失，细胞形态以纤维样细胞为主，种类单一。HUC-MSCs比hUCB-MSCs原代培养期短，培

10、养成功率明显提高。羊膜是膜最内层，胎盘包裹胎儿面的薄、半透明膜的形成，由人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞组成，其表面没有神经、血管、肌肉、淋巴等组织。人羊膜间充质细胞最初起源于胚胎中胚层。人羊膜上皮细胞起源于胚胎外胚层。越来越多的研究证实，人羊膜间充质细胞和人羊膜上皮细胞具有干细胞的特征。其中人胎盘羊膜来源的间充质干细胞(human am nion-derived mesenchymal cells，had-MSCS)，不仅表达成体干细胞的特征，还表达了某些胚胎干细胞的特性，人羊膜间充质干细胞是胚胎干细胞多功能标记转录因子基因OCT4，SOX2比较人羊膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞增殖的研究

11、结果表明，培养人羊膜间充质干细胞的细胞数量在所有时间都明显高于骨髓间充质干细胞(徐彪等，2013年)。红燕等(2014年)分别从绒毛膜和绒毛营养层分离培养MSC，分离过程中从绒毛膜和绒毛营养层获得的细胞量大，绒毛营养层的细胞量也超出了绒毛的细胞量。但是接种后培养时绒毛滋养膜血细胞较多，血细胞难以处理，影响间充质干细胞的附着作用，使其不能附着在壁上，不能继续生长，因此后期细胞的生长缓慢，收获细胞较少。根据寒流等(2013)的研究结果，母体的淘汰组织也可以单独准备MSC。苗钟宁等(2009)将胎盘组织分为中央带组脐带附着，边缘带组脐带附着点最远的地方和中央组之间的中点三个组。通过分别对CD166、

12、CD44、CD29进行免疫荧光和免疫组织化学染色，在显微镜下观察阳性细胞表达和分布区域，发现中间层阳性细胞数和表达水平优于绒毛层和底层。在中间层的情况下，中央比中央和边缘区带表现得更强。据推测，在接近血管丰富的脐带附着部的胎盘中间层，很容易获得更丰富的PMSCs。脐带、胎盘MSC的分离纯化2.1胎盘组织的获取、储存和清洁母体血液测试HBV、HCV、HIV、CMV、EBV、梅毒都是阴性。产妇没有传染性，胎儿没有先天性疾病。临床足月正常剖宫产后胎盘、大小及质量正常范围，胎盘脐带附着点在胎盘中央稍有偏差。与产妇及其家属签署以信息为基础的同意书的实验方案得到了医院伦理委员会的批准。在产房无菌状态下获得

13、脐带，胎盘。在文献报告中采取组织后，有以下处理方法。立即浸泡在胎盘保管箱中(包括加拿大LABPLAS公司的无菌取样袋，99%低糖DMEM，1%双抗克隆链霉素的组织保护液)，48 h内移至实验室。在4 的冰箱里安静地放置脐带，观察保存脐带的PBS液，表明没有混浊就没有感染。脐带采集后6小时内处理，切除双侧大头针和淤青的部分。无菌采集健康足月剖宫产羊膜，冰箱内2小时进入实验室程序。健康的足月剖宫产胎盘立即进入无菌采集、分离提取程序。文献报告中组织块的使用和获取：胎盘组织约50克胎盘小叶35个把胎儿侧绒毛层组织切成10毫升眼科手术剪刀组织切割(小块；1mm3大小；可以用吸管吸收的肉味形状。大约3毫米

14、；5 mm3大小的片段)组织粉碎机(近似肉糜)文件的组织浸泡液/清洗液：#生理盐水# D-Hanks平衡溶液#磷酸缓冲液(PBS)# dushi磷酸缓冲液(D-PBS)#含肝素的PBS#包含双抗生素的PBS (0.1%链霉素，1%链霉素，100 U/mL青霉素，100 g/mL链霉素)#无血清DMEM /F12培养基，包括青霉素和链霉素2-2脐带、胎盘MSC的分离纯化报告了脐带、胎盘MSC的分离方法：组织块附着法、酶消化法、全灌注法。用组织附着培养法获得的细胞纯度高，对细胞伤害少，操作比较简单，将组织块切碎，贴上壁后，放入培养基进行培养，但初级培养需要更长的时间，细胞数量得到比较有限。利盐池等

15、(2014)首次组织块附着培养接受MSC后，将组织转移到新的培养瓶，继续培养，2、3天后还能看到胆壁细胞，第5天将进行明显的细胞复制。这种改进的组织块二次附着方法可以在短时间内获得大量原生细胞。酶消化法可以直接消化原生细胞，但获得的细胞纯度稍低，状态不均匀，消化时间太短，不能得到足够的细胞，消化时间太长，对细胞造成伤害，破坏细胞膜成分，使其不能粘在墙上，影响细胞的生存率和增殖能力，甚至导致细胞凋亡，使后续培养变得困难(二碱等，2014)；在一些组织中，离心力不容易，例如用酶消化的脐带Whartons胶。徐妍等2009比较中，610 d在块边爬出纤维样细胞，在原代细胞克隆数、细胞产量、传代时间和

16、扩增倍数方面，胶原酶消化法(1 g/L胶原酶3.0 5.0mL，位于具有双重耐受性的PBS中，在37 孵化0.5 h胶原酶和胰蛋白酶联合消化法(1 g/L胶原酶在37 孵化16，用PBS冲洗后，在37 孵化25 g/L胰蛋白酶0.5)接种后，没有明显的附着细胞。常用酶包括胰蛋白酶、胶原酶、等。胰蛋白酶消化力强，型胶原酶消化力相对弱，但细胞膜损伤较小。很多研究人员对酶浓度、消化时间、消化方法、多种消化酶结合消化进行了很多探索。想办法充分分离细胞，避免细胞损伤(赖平等，2016)组织要用酶消化，然后用屏幕/多层纱布滤除(100颈部，200颈部，300颈部，100米的过滤器)未消化的大型组织块。过滤后的细胞成分复杂，经常含有很多血细胞。现阶段用于分离纯化中叶干细胞的方法主要包括一般离心、密度梯度离心法、附着筛选法、红细胞分解液法、淋巴细胞分离液(Ficoll)、羟乙基淀粉沉淀、流式细胞术或磁珠排序。间充质干细胞没有特定的表面标记，因此使用流式细胞术或磁珠排序法，会损失很多细胞，成本很高。每种方法都有优缺点。使用红血球分离液对间充质干细胞的损伤较大，使用淋巴分离液分离重复性弱，技术不稳定(红燕等，2014)。文献报道的消化酶的浓度、消化时间、次数和