细胞培养及材料细胞毒性检测

1、细 胞 培 养 cell culture,前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测,主要内容,Wilhelm Roux (1850-1924 ),1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。,1.前言,Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873 d. 1944,1907年Harrison 和1912年Ca

2、rrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。 他建立的鸡胚胎成纤维细胞持续了34年之久(1912-1946),器官培养 (Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小片组织（O.51立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。 细胞培养(cell culture)：把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，后进行培养，增殖。,2.基本概念,肿瘤,胚胎,成体,粗切,消化,细切,修切,细胞培养,组织培养,器官培养,细胞培养的优点,活细胞

3、 便于观察检测 条件可控 均一性 便于人工筛选,培养细胞与体内细胞的差异,失去原有组织结构和形态，趋向单一性 分化减弱 可能获得不死性,体外培养细胞的生长类型,贴壁型：动物的正常细胞 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 固定化培养,来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出23个长短不等的突起 中有卵圆形核,成纤维细胞样细胞,生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动,培养细胞的生长和增殖过程,原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞 原代

4、培养：将从体内取出的细胞进行培养 传代培养：从原代培养细胞继续转接培养 传代细胞：在体外培养条件下持续传代培养的细胞,细胞培养的工作原则,无菌 无毒、生物相容性 清洁的环境 品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和去离子水 有标准化的工作方法 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放,3.细胞培养的基本条件,无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，

5、电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞生长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱,常用仪器与设备,超净工作台 高压蒸汽灭菌器 过滤除菌装置 倒置显微镜 水纯化装置 恒温培养箱 电热干燥箱 离心机、天平、水浴、摇床 液氮罐 冰箱：4、-20 、-80 ,细胞培养器材,移液器 移液管 吸管 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 培养皿： 30、60、120毫米 多孔培养板： 4、6、24、96孔 离心管 冻存管,基础培养基 8095 血清 520 青、链霉素 各100Uml

6、,完全培养基的组成,天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）,培养基,合成培养基： 根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 包括四大类物质：无机盐、氨基酸、维生素、碳水化合物 目前常用培养基：RPMI-1640、DMEM、M199、MEM、 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性） 56 ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌,血清的使用,其他细胞培养用

7、液,水：新鲜的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液 主要由无机盐和葡萄糖配制而成 作用：维持渗透压、缓冲和调节酸碱度 常用的缓冲液： 生理盐水 PBS Hanks液 （D-Hanks常用于配制胰酶溶液）,抗生素溶液,通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。 使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。 庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。,主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁

8、细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。 常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hanks配制，用滤器过滤除菌。 消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。,胰蛋白酶溶液,消化液：胰蛋白酶溶液、EDTA溶液、胶原酶溶液,贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。,4.细胞培养的基本方法,粘着、粘附 （attachment）,铺展 （spreading),得到细胞,1）取材 切割,组织块培养法,消化培养法,2）直接购买 培养,（原代培养）,传代,体外培养的原代细胞或细胞株要在体外持续地培养就必

9、须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续。 培养的细胞形成单层汇合以后，由于密度过大生存空间不足而引起营养枯竭，将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:2或l:3以上的比率转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。,弃去旧培养液 清洗 加入消化液 吸弃消化液 加入培养液 吹打分散细胞 分装稀释细胞 补加培养液 继续培养,接种数量为51048105个/ml。 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而呈现黄色，表明细胞已经达到最大密度需要换液或进行传代培养。 如果是单层贴壁的细胞，等长满培养瓶表面，即可进行传代。,传代注意事

10、项,游离期 悬浮，胞质回缩，全部细胞变为圆球形。 吸附期 贴附底物，一般24小时内贴壁。 潜伏期 此时细胞有生长活动，基本无增殖。 细胞株潜伏期一般为624小时。 对数生长期 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期） 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。 机制：接触抑制、密度依赖性,细胞传代的增殖生长过程,细胞观察,肉眼观察：培养液的颜色和透明度 显微镜观察 生长良好的细胞：细胞透明度大，折光性强，轮廓不清 生长状态不良的细胞：细胞轮廓增强，细胞折光性变弱；胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质；细胞之间空隙增大；细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生

11、圆缩脱落；有时细胞表面及周围出现丝絮状物,细胞计数,每毫升细胞数 血细胞计数板,细胞生长的指标,细胞生长曲线 贴壁率 有丝分裂指数(MI)：分裂相数量占全部细胞数量的百分比 细胞群体倍增时间 四唑盐(MTT)比色法 标记胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入量,细胞活力测定,细胞活力：总细胞中活细胞所占的百分比 台盼蓝法 四唑盐(MTT)比色法 荧光素双乙酸酯法(FDA),四唑盐（MTT）比色法 MTT比色法的原理： 活细胞中琥珀脱氢酶能将四唑盐还原成不溶干水的蓝紫色产物甲臢（formazan)，并沉淀在细胞中，而死细胞没有这种功能。 二甲亚砜（DMSO）能溶解沉积在细胞中蓝紫色结晶物，溶液颜色

12、深浅与所含的formazan量成正比。 甲臢染料在A570nm处产生吸收值，用酶标仪测定A值。,细胞培养的其他指标,细胞大小：显微测微计法 细胞重量：称重法 鲜重 干重,细胞固定与染色,细胞固定 苏木精-伊红染色 Giemsa染色 Feulgen染色 考马斯蓝染色 免疫法 细胞核染色：Hoechst、DAPI,细胞污染,混浊、pH异常改变、细胞外形模糊、漂浮的集落 细胞出现增殖缓慢或死亡 化学物质的污染 非同种细胞污染 微生物污染：细菌、真菌、支原体、病毒,5.细胞培养的污染和检测,细菌污染,培养液变黄，出现浑浊 镜下可见圆球状颗粒漂浮 预防和处理：青霉素、链霉素,真菌污染,培养液一般不浑浊

13、白色或黄色小点漂浮于培养基表面 光镜观察到菌丝 预防和处理：抗真菌剂,支原体污染,可透过滤膜 无细胞壁,细胞营养液仍清亮但变黄，细胞生长变缓，部分细胞发生脱落，细胞间隙可见铺满细沙样小点。,污染的控制,预防 重新培养 鉴别 清除：抗生素、加温、支原体特异性血清、共培养法、重新克隆法、动物体内接种除菌法 防止交叉污染,6.细胞冻存与复苏,慢冻快融 低温保护剂：10%的甘油或二甲亚砜DMSO,细胞深低温保存的基本原理： -80以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。,慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成

14、冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反，冰晶很大，大冰晶会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。,7.细胞的管理及保藏,对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称；细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义缩写字母或代号表示。但不论什么形式，均不宜太长，以便记忆和了解。 HeLa：为供体患者的姓名(Henrietta Lacks，来源于宫颈癌) CHO：中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary) NIH/3T3：美国国立卫生研究所(National Institute of Health

15、)建立, 每3天传代一次，每次接种3106细胞毫升。,细胞库的建立,主细胞库 生产用细胞库,原始细胞库,主细胞库,生产细胞库,细胞保存机构,ATCC (American Type Culture Collection) ECACC (European Collection of Cell Cultures) .uk 中国科学院典型培养物保藏 委员会细胞库 ,8.细胞毒性检测,参照GB/T16886.5-2003（或ISO10993-5） ，医疗器械生物学评价-第5部分：细胞毒性试验体外法规定的方法进行检测。,样品准备 辐照灭菌 将待检材料在相应条件下浸提（不含血清的培养基中在37环境下浸提24h） 细胞计数 接种于96孔培养板，置CO2培养箱37培养24h后，弃去原培养液。空白对照组加入新鲜细胞培养液，供试品加入样品浸提液（加血清），置CO2培养箱继续培养（至少24h） 于设定培养时间后置显微镜下观察细胞形态，每孔加入20L质量浓度为5g/L的MTT溶液，继续培养4h后弃