实时荧光定量PCR在临床医学中的应用.ppt

1、实时荧光定量聚合酶链反应在临床医学中的应用，2、罗氏应用科学部在临床医学中的整体解决方案，基因诊断病原体的测定，肿瘤诊断基因的差异表达研究，主要内容，3、4、聚合酶链反应和基因诊断技术，基因诊断是通过核酸的分子生物学检测直接检测基因的存在或缺陷来诊断疾病的方法。聚合酶链反应，聚合酶链反应，是一种快速的DNA扩增技术。1998年，荧光定量聚合酶链反应技术开始在中国应用于临床检测。5、荧光定量聚合酶链反应技术，实时荧光定量聚合酶链反应技术，是在反应体系中加入荧光标记，利用荧光信号积累实时检测整个聚合酶链反应过程，通过标准曲线分析聚合酶链反应的最终产物，最终实现未知初始模板的定量分析的技术。这是迄今

2、为止已知基因序列核酸测定最灵敏的方法。荧光染料：SYBR Green I，EVA Green，ResoLight荧光探针：TaqMan，杂交探针，分子信标，6，罗氏应用科学部集成细胞学和基因组学的研究过程，光循环仪实时聚合酶链反应平台在实时荧光聚合酶链反应技术上创新十多年，1998，2003，2009，2005/2008，2008年8月，光循环仪480的广泛应用，绝对定量，相对定量，基于熔解曲线的基因分型，结束罗氏应用科学部在临床诊断、基因诊断、病原体检测、定性分析、绝对定量耐药研究、肿瘤诊断基因差异表达研究等方面的整体解决方案，主要内容，10、荧光定量聚合酶链反应技术的临床应用、病毒性肝炎(

3、HBV、HBV-雅明、丙型肝炎)基因检测、性病相关病原体(沙眼衣原体、衣原体、解脲支原体、人乳头瘤病毒)优生优育工程诊断：人巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒(单纯疱疹病毒)2型、风疹病毒检测其他病原体：肺炎支原体、爱泼斯坦-巴尔病毒、伤寒杆菌11、HBV DNA检测缩短了“窗口期”，这有利于献血者窗口期病毒核酸的筛查和早期诊断。12.荧光定量聚合酶链反应检测HBV病感染的不同阶段。13.治疗乙型肝炎，有两种主要的抗病毒药物对慢性乙型肝炎有明确的疗效：干扰素:重组人干扰素-1b、干扰素-2a、干扰素-2b和其他核苷类似物：拉米夫定、阿德福韦。14，HBsAg和HBeAg呈阳性，但HBV DN

4、A呈阴性？干扰素或拉米夫定治疗后，病毒复制受到抑制。与聚合酶链反应中使用的引物相对应的DNA序列发生突变，并且该引物不能与突变的DNA配对。病毒DNA整合到宿主肝细胞的染色体中，但血液中的游离HBV DNA很少或缺乏。15、抗病毒治疗中的问题 YMDD突变在反转录酶催化中心，YMDD:酪氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸-蛋氨酸-天冬氨酸(M)突变为异亮氨酸(I)或缬氨酸(V)形成YIDD变异体或YVDD变异体，16、HBV-YMDD变异体检测的临床意义，动态检测：服用拉米夫定3个月，每月检测一次，早期检测：变异体可在耐药临床表现发生前1-4个月检测，及时调整：及时调整给药方案17.摘要：结核分枝杆菌12

5、个MIRU-VNTR位点的HRM基因分型应用介绍，庞昱等.微生物学方法杂志，2011年，第1期，不同MIRU40位点的HRM分析结果。R=重复，统计88株不同MIRU40数菌株的Tm值，进行流行病学研究，18、总结，荧光定量聚合酶链反应可以定量检测病原微生物的核酸含量，弥补免疫检测(如丙型肝炎病毒)的缺陷，缩短诊断(如艾滋病病毒)的窗口期，便于早期诊断，在治疗过程中监测疗效，指导用药过程和剂量，制定合理的疗效方案，结合临床表现，并与免疫学、影像学等传统诊断方法进行综合判断，更加科学。19、罗氏应用科学部在临床医学、基因诊断病原体测定、肿瘤诊断突变检测、个性化药物甲基化基因差异表达等方面的整体解

6、决方案，主要内容，高分辨率熔解曲线的定义，高分辨率熔解曲线(HRM)是传统熔解曲线分析的延伸。它需要特殊的荧光染料、高性能荧光定量聚合酶链反应仪器和高分辨率的特殊分析算法。它能区分多组单核苷酸多态性、突变的核酸样品，并能区分野生型(纯合子)和突变型(纯合子)。杂合子使我们能够直接筛选聚合酶链反应扩增产物的遗传变异(单核苷酸多态性)，而无需测序和其他方法。此外，通量更高，单一成本更低！21，HRM的应用，SNP基因座(已知和未知基因座)单体型分析的检测，杂合性缺失的筛选，群体中显性等位基因的分析，物种鉴定，DNA遗传作图，潜在易感基因的筛选医学应用：产前诊断，传染病和遗传病的监测，药物疗效的观察

7、和突变，包括小片段的插入和缺失医学应用：肿瘤的快速诊断，治疗和预后评估甲基化应用医学应用：快速诊断， 肿瘤的治疗和预后评估，饱和荧光染料创新的饱和荧光染料能识别单碱基突变而不抑制聚合酶链反应，不饱和双链DNA荧光染料SYBR Green I的纯合子和杂合子的熔解曲线基本相同，饱和双链DNA荧光染料ResoLight、LCGreen和EvaGreen均为绿色荧光染料，最佳激发波长范围为440-470nm，发射荧光波长为470-520nm。序列变化将导致熔解曲线发生显著变化。 纯合子和杂合子，创新的HRM染料能准确地区分野生型纯合子和杂合子LC 480 HRM主混合物分辨染料、Sybr绿色I对光循

8、环仪480分辨染料，提供更高的信号灵敏度和分辨率，24。HRM技术与dHPLC HRM、wt、mut、het、wt、wt、wt、mut、mut、mut、Wthet、no分离同质变异体、fab ex15j、318bp扩增子、SNP a/g、基于基因扫描的PCR产物基因分型的高分辨率解链曲线、26、两个同源双链体、两个异源双链体、四个观察到的双链体结构、杂合扩增、基因扫描高分辨率解链分析、病例3360 LPLH3基因突变(SNP CT) PCR产物大小164 bp,LightCycler 480 HRM应用程序简介基因扫描显著降低测序成本，甘露糖结合凝集素MBL2基因序列变异分析(384个样品，扩

9、增子长度219 BP) :图像上将四种最常见的基因型分为四组； 在少数样本中还有另外三种遗传变异，29。突变定量分析：CYP2C9中约16%的临床药物(如华法林、甲苯磺丁脲和苯妥英)被CYP2C9代谢。部分T等位基因50%，1:1 20%，1:5 14%，1:7 10%，1:10%，1:250%，144个碱基的扩增子，单核苷酸多态性位点，30个，凝血因子的突变检测，因子的单碱基置换导致50%的急性血友病甲。由于该基因的转录本长达9kb，外显子很小(69-262个碱基)，所以价格昂贵有了人力资源管理，90%的突变可以被筛选出来。通过高分辨率熔解分析检测因子VIII基因突变。劳里等人。2007年3

10、1月，用HRM法检测KRAS基因的敏感性，扩增片段为92bp。在突变质粒比例分别为0%、2%、5%、10%、20%、50%和100%的混合质粒DNA序列中，HRM分析方法只能明显检测到2%的突变DNA。，32，不同的KRAS突变类型在HRM解释图中显示出与野生型不同的曲线，33，罗氏应用科学部在临床医学中的整体解决方案：基因诊断病原体测定肿瘤研究突变检测甲基化检测基因差异表达研究，主要内容，34，在正常细胞中，CpG组分在非甲基化状态下的甲基化研究对于理解基因的调控方式和疾病的分子生物学机制具有重要意义：发育、癌症和肿瘤发生、基因印迹、X染色体失活和相关遗传疾病。在特定条件下，如许多发育相关基

11、因，在特定发育阶段去甲基化表达肿瘤的DNA甲基化变化表明整体甲基化水平降低，启动子区CpG岛的甲基化水平升高。肿瘤抑制基因和修复基因的甲基化导致肿瘤抑制基因沉默和修复基因失活。然而，整体的低甲基化使反转座子和癌基因活跃，染色体不稳定。基于特定甲基化标记的量化，不同患者的风险水平被分级，并且研究了DNA甲基化现象和疾病。35、2。聚合酶链反应扩增，尿嘧啶经聚合酶链反应扩增后转化为胸腺嘧啶，使甲基化差异转化为碱基序列差异。用硫酸氢盐处理变性的脱氧核糖核酸，未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶、甲基嘧啶、甲基嘧啶、甲基嘧啶、胞嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶、尿嘧啶。分析：测序、

12、甲基化特异性聚合酶链反应、引物延伸、限制性酶切、杂交或实时聚合酶链反应！DNA甲基化研究的常规程序，36，使用定量高分辨率熔解分析对结直肠癌患者档案组织中的DNA甲基化的高质量评估。巴尔集成电路，硕士等(2009)，摩尔。diagn。11，102-108。在肿瘤发生过程中，高甲基化启动是抑制基因转录的常见机制，也是肿瘤发生的特征之一。组织的适当保存是检测重要生物标志物的重要来源。DNA甲基化分析是早期癌症监测、风险分析和治疗的理想方法。使用HRM分析方法，可以稳定地检测1%甲基化的DNA，37，甲基转移酶MGMT和肿瘤预测和个体化治疗，Krypuy，M .等.使用光循环仪480系统的快速高通量

13、甲基化分析。Biochem ICA 1，1113；2008年，O6-甲基鸟嘌呤脱氧核糖核酸甲基转移酶MGMT是一种修复细胞内脱氧核糖核酸损伤的酶，可以修复由各种烷化剂引起的脱氧核糖核酸烷基化损伤。细胞中MGMT的水平决定了细胞对烷化剂的耐药性。MGMT的甲基化程度直接反映了它的表达水平。38、罗氏应用科学部在临床医学基因诊断病原体测定肿瘤诊断基因差异表达研究中的整体解决方案早期筛选分子指纹图的主要内容，39、qPCR图谱作为肿瘤指纹图进行早期筛选，早期筛选恶性生长的肿瘤将引起血液生化环境的特征性变化，从而影响部分基因在血细胞中的表达。根据不同肿瘤与免疫系统之间的关系，利用人类全基因表达差异(生

14、物芯片)分析外周血细胞的表达谱，筛选出与肿瘤相关的表达差异基因。乳腺癌早期诊断(荧光定量聚合酶链反应):通过分析人类基因组在外周血细胞表达谱中的表达差异，筛选乳腺癌早期诊断的基因标志物，利用实时荧光定量聚合酶链反应技术检测乳腺癌标志物在临床血样中的表达差异，检测结果可用于乳腺癌的早期筛查和辅助诊断。，40，qPCR作为神经母细胞瘤的指纹，使用多基因e-表达信号预测神经母细胞瘤儿童的预后。维穆伦，j .等人(2009)。柳叶刀肿瘤。10，663-671。在最大的神经母细胞瘤库中建立并验证了大量预后性多基因表达(n=579)。实时定量聚合酶链反应(qPCR)检测只需要20ng的核糖核酸，并使用59

15、个预后基因和5个内部参考基因。由该验证结果形成的“指纹信息”可以用作独立的风险预测机制，从而可以在当前治疗组中识别可能恶化的患者。多因素疾病的治疗预后一种检测gstm1和gstt1拷贝数的多重实时聚合酶链反应方法。timofeeva，m .等人(2009年)，临床生物化学42，500-509。谷胱甘肽结合对致癌物的解毒和药物代谢非常重要。人体内大量的谷胱甘肽硫转移酶1和谷胱甘肽硫转移酶1被删除。谷胱甘肽硫转移酶基因缺失的多样性对于多因素疾病，如不同类型的癌症，具有潜在的风险和可预见的因素。通过多重聚合酶链反应在LightCycler 480上对谷胱甘肽转移酶1和谷胱甘肽转移酶1进行基因分型，内参照基因为白蛋白。使用LightCycler 480软件对所有Ct值和标准化比率进行相对量化。这种新的半定量基因分型方法灵敏度高，是大规模分子流行病学和临床研究的理想工具。欧洲航天局任务中宇航员的基因表达在太空旅行前后有什么变化吗？GPCRs通过c