鼠疫实验室检测技术

1、.,鼠疫实验室检测技术,.,鼠疫实验室检测,针对病原体本身的生长繁殖、生理生化特性的检测：鼠疫菌的染色检查；鼠疫菌的培养及鼠疫噬菌体试验；鼠疫菌的生化检查、营养需求、毒素检测、毒力测定等。 针对病原体特异性抗原结构的检测：鼠疫F1抗原抗体检测；鼠疫菌外膜蛋白的检测。 针对病原体遗传基因的检测：鼠疫菌的质粒检测；鼠疫菌特异性核酸片断的检测；鼠疫菌全基因组测定；插入序列的检测。,.,一、鼠疫菌菌体形态检查,典型的鼠疫菌呈短而粗，菌体长12m，宽0.50.7m,中段膨大，两端钝圆，且两极浓染的卵圆形小杆菌，有荚膜，无鞭毛，无芽胞。革兰氏染色阴性。 染疫动物或患者及其尸体的新鲜脏器制备的压印片，可见到

2、两端钝圆、两极浓染的典型鼠疫菌。压印标本中可在吞噬细胞内外见到鼠疫菌，对于鉴别杂菌污染材料极有价值。 鼠疫菌染色方法有革兰氏染色（菌体染成红色）、美兰染色（菌体染成兰色，两极浓染明显）、姬姆萨染色（菌体染成色，荚膜染成色）,.,鼠疫菌染色检查(脏器压印片),美兰染色,革兰氏染色,.,鼠疫菌染色,鼠疫菌涂片的革兰氏染色,.,鼠疫菌染色检查,Wayson stain(魏申氏染色)呈现的两极浓染特征,荚膜染色墨汁负染色,.,二、鼠疫菌的培养特性,鼠疫菌是典型的异养菌。 鼠疫菌为需氧菌，亦为兼性厌氧菌。 鼠疫菌在普通培基上生长良好，培养的最适温度为28，最适pH为6.9-7.1，发育初期的最适氧化还原

3、电位（Eh）约为100150mV，接种后至少20h以上才能形成肉眼可见的菌落，一般2448h形成肉眼可见的小菌落。 强毒鼠疫菌对钙离子有半依赖性，缺乏时生长不良。37缺钙条件下强毒鼠疫菌生长受限并释放大量Yops,表现很强的表达和分泌毒力蛋白V抗原（LcrV）。此现象称为低钙反应，受70kb(45MD)质粒上的遗传基因控制。 典型鼠疫菌培养18-20h光镜下呈透明的碎玻璃片状。培养24h以上菌落在透过光线下呈灰白色略带淡青色，反射光线下菌落圆形隆起呈淡灰白色，镜下见菌落中心发暗，有黄褐色粗糙颗粒，周边围绕一圈宽窄不等，边缘不整呈锯齿状、薄而透明的花边。,.,鼠疫噬菌体试验,在培基上密集平行划线

4、培养鼠疫菌，鼠疫噬菌体滴于上端划线中部，直立平板，使噬菌体液垂直划线自然流下，置20培养24h,有明显的噬菌带。 在1822鼠疫噬菌体只能裂解鼠疫菌而不裂解假结核菌，具有较强的专一性(噬菌作用具有种的特异性)，是鼠疫细菌学诊断中特异的鉴定方法之一。 鼠疫噬菌体试验可快速诊断鼠疫菌。对被检材料作细菌分离培养的同时作噬菌体裂解试验，20h左右即可获得结果。 分离到鼠疫噬菌体，可以间接判定检材中存在鼠疫菌。,.,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,典型鼠疫菌菌落形态,噬菌带,.,鼠疫菌培养及鼠疫噬菌体试验,鼠疫菌培养特征,鼠疫噬菌体试验,.,三、鼠疫F1抗原、抗体检测,鼠疫F1抗原检测 1.反向血球凝集试验

5、(RIHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA) 4.免疫荧光技术(IFT),鼠疫F1抗体检测 1.间接血球凝集试验(IHA) 2.酶联免疫吸附试验(ELISA) 3.胶体金免疫层析法(GICA),.,间接红血球凝集试验(IHA),鼠疫菌特异性F1抗原致敏经单宁酸鞣化处理的醛化绵羊红血球，制备成F1抗原致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗体。试验方法和结果判定均为常规操作。 IHA微量法结果：,.,反向血球凝集试验(RIHA),用F1抗体致敏血球，检查鼠疫特异性F1抗原。试验方法和结果判定与IHA相同。 RIHA微量法结果：,.,酶联免疫吸附试验(ELISA),测抗

6、体. 双抗原夹心法：F1抗原包被反应板，加入待测标本28反应1.5h洗板，加入HRP-F1抗原28反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液(2mol/L硫酸)。 间接法： 已知F1抗原包被反应板，加标本37反应1h洗板，加入酶标二抗37反应1h洗板，加入底物(如OPD或TMB)蔽光反应30min显色后加终止液。 用肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),测抗原 双单抗夹心法： F1-McAb包被反应板，加入标本28反应1.5h洗板，加入HRP-F1McAb 28反应1h洗板，加入底物OPD蔽光反应30min后加终止液。 双抗体夹心法(改良法-美国CDC鼠疫诊断技术实验室

7、操作手册)：鼠疫免疫血清特异性抗体( F1Ab)包被反应板，加标本37反应1h洗板，加小鼠F1McAb 液37静置1h洗板，加HRP标记的羊抗小鼠IgG 37反应1h洗板,加底物OPD蔽光反应30min显色，加终止液。 肉眼观察结果并用酶标仪检测每孔的吸光度值(A),.,胶体金免疫层析法(GICA),检测鼠疫菌特异性抗原、抗体的金标技术以GICA广泛用于实践。基本原理均为夹心法。 双抗体夹心法测抗原：固定于NC膜上的单抗(F1McAb)+标本中待测抗原(F1Ag)+金标记的另一株单抗(金标-F1McAb)显色。 双抗原夹心法测抗体：固定于NC膜上的鼠疫F1抗原(F1Ag)+标本中待测抗体(F1

8、Ab)+金标记的F1抗原(金标-F1Ag)显色。 夹心法测抗体：固定于膜上的鼠疫F1抗原标本中的相应抗体金标记的SPA显色。,.,GICA双抗体夹心法测抗原,G区：金标特异性抗体(鼠型F1McAb),C区：羊抗小鼠Ig,T区：特异性单克隆抗体(F1McAb),吸水纸,标本,.,免疫荧光技术(IFT),标记物-荧光素(如异硫氰荧光素FITC) 荧光素标记抗体检测相应抗原-直接法：如FITC-FIMcAb为异硫氰酸荧光黄标记鼠疫F1单克隆抗体。 方法：固定好的玻片标本用1%牛血清PBS浸洗5分钟，流水冲洗。用FITC-FIMcAb适量（0.2ml）荧光染色，室温作用30分钟，流水冲洗。干燥，荧光显

9、微镜油镜观察，鼠疫菌染上翠绿色荧光,Yersinia pestis 免疫荧光染色 Fluorescence antibody positivity is seen as bright, intense green staining around the bacterial cell,.,鼠疫菌特异性基因片断检测PCR,目标基因：鼠疫菌的fra和pla特异性基因片段 引物序列和扩增产物的长度 目标基因 引物序列 产物长度 fra 1F 5-GGAACCACTAGCACATCTGTT-3 249 bp 1R 5-ACCTGCTGCAAGTTTACCGCC-3 pla 2F 5-ACTACGACTG

10、GATGAATGAAAATC-3 456 bp 2R 5-GTGACATAATATCCAGCGTTAATT-3 内部对照：以鼠疫菌EV株DNA为模板，采用上述f1引物扩增出fra基因249 bp片段，再以16SrRNA基因引物： F 5-AGCGGCAGCGGGAAGTAGTT-3 R 5-TCAACCCCTTCCTCCTCGCT-3 扩增出16SrRNA基因396bp片段加载体重组而成，产物长度645 bp ，使用了内部对照，可有效的防止假阴性结果。 应用多重PCR方法来检测鼠疫菌，所选取的扩增区域都为鼠疫菌的特异区域，可有效地将鼠疫菌与其它细菌相鉴别，具有较高特异性。,.,鼠疫PCR反应体

11、系,PCR反应体系(总量25l)采用其它总量时，下列配方按比例改变。 无菌去离子水 13.5l 10反应缓冲液 2.5l 4dNTP混合物（每种2.5mM） 2l 引物（1F、1R、2F、2R） 各1l 内部对照模板(IC) 1l 待测标本 1l Taq DNA 聚合酶 1l,.,鼠疫PCR,反应条件(扩增) ：预变性95 5min，1个循环；然后95 1 min，55 1 min，72 1 min，30个循环；最后72 5 min。共1小时40分。 电泳：反应管中加溴酚蓝指示剂5l，混均短暂离心。胶体的每一孔中加入上述处理的反应产物8l，在80-100V(不超过5V/cm)电压下TBE缓冲液

12、中电泳约1小时。凝胶成像仪读取结果并照相。,.,多重PCR扩增结果,鼠疫PCR 内部对照质粒与不同浓度EV菌 PCR扩增结果,鼠疫多重PCR 多重PCR扩增结果,.,鼠疫菌质粒检测,鼠疫菌的三个寻常质粒： pPCP1 6Mda(9.5kb)编码鼠疫菌素，鼠疫菌素耐受，凝固酶和胞浆素原活化因子； pCD145 Mda(70kb)编码型分泌系统的质粒，即主要编码低钙反应并表达LrcV及一系列耶尔森菌特有的Yops； pMT1 65Mda(100kb)编码F1抗原和鼠毒素。 91001全基因组测序新发现的质粒：pCRY长度21742bp，具有独立复制能力，有一群编码型分泌系统的基因。 质粒DNA提取-碱裂解法和热裂解法 质粒电泳分析,.,鼠疫菌研究进展,传统的病原体分类(classification)和鉴定(identification)方法: 病原体的形态特征 生长特征(培养特性) 血清学反应 生化特征 基因分类(Genotyping)和鉴定方法:多是基于PCR和核酸凝胶电泳技术，通过电泳条带模式比较分析，