博士开题报告

1、,堆肥提取液的功能研究,汇报人：李欣欣,*,内容,研究背景,国内外研究现状,研究内容及方法,技术路线,问题及讨论,*,堆肥提取液(compost tea,compost extracts)是指堆制腐熟的有机物料经过不同的方法提取后的水提取液。 近年来的研究结果表明，不同来源的固体废弃物堆肥或者它们的提取液不仅能够促进作物生长、改善作物品质和增加作物产量，而且对于土传病原菌有明显的抑制效果，可发展成一种替代化学农药防治某些植物病害的有效手段，具有肥药合一的作用。,研究背景,*,生产工艺主要有两种： 好气提取：将腐熟的堆肥加入到一定比例的水中，在搅拌或充氧条件下提取2448h(DO6ppm)，过滤

2、而成。其特点是提取时间短，但是需要外在能源的补充； 厌气提取：直接将腐熟的堆肥加入到一定比例的水中提取5到10天(最长时间甚至要2个星期)，过滤而成。其特点是提取时间较长，不需要额外的能源供应。,图1 堆肥茶发酵装置,*,促生和生防效果受以下因素的影响： 生产过程中的因素:包括堆肥来源、堆肥腐熟程度、堆肥和水的提取比例、提取过程是否通气或搅拌、提取时间、添加的营养物质、提取温度和提取液的pH值等; 实际应用中的因素:例如稀释比例、喷施方式、喷施时间、喷施时是否添加菌剂等。,*,（1）徐大兵等人以猪粪-秸秆堆肥为原料，研究了不同的提取工艺（好气或是厌气提取、通气量、不同的提取比例、提取时间）对堆

3、肥提取液的化学组成和微生物组成的影响、对黄瓜促生效果的影响以及对植物病原真菌和番茄根结线虫的抑制效果； （2）Yasmeen Siddiqui等的研究发现，油棕果实废弃物堆肥和水稻秸秆废弃物堆肥的液态提取物经木霉加强后，可以替代无机化肥和杀真菌剂，能够改善黄秋葵的生理生长状况、降低湿腐病的发病率、进而提高其产量。,国内外研究现状,*,（3）Karuna Shrestha等，研究发现在好气提取堆肥浸提液中添加营养物质（糖蜜、藻类提取物）能够显著地增加提取液中细菌和霉菌数量；将堆肥装在布袋中不会影响浸提效果；采用1:10的稀释比例、维持液体溶解氧含量在6ppm以上时，浸提液的营养物质含量和微生物数

4、量最高。 （4）Yasmeen Siddiqui等,以堆肥茶配合无机肥料施用到砂质黏壤土，栽培后的积雪草的产量、总抗氧化性物质含量、生物活性物质（积雪草苷、积雪草酸、羟基积雪草苷）含量最高。,*,堆肥提取液对5种植物病原菌的抑制效果 堆肥提取液提取工艺优化 温室盆栽实验探究抑菌效果 堆肥提取液生防机制的研究,*,堆肥提取液对5种植物病原菌的抑制效果,堆肥： 秸秆牛粪堆肥、白灵菇菌糠堆肥 植物病原菌：大丽花轮枝孢（草莓黄萎病菌）、恶疫霉、瓜果腐霉、瓜枝孢（黄瓜黑星病菌）、黄瓜枯萎病菌 实验方法：菌丝抑制试验 、孢子抑制率试验 实验进展：,*,*,白灵菇菌糠堆肥提取液对瓜果腐霉的抑制效果 秸秆牛粪

5、堆肥提取液对瓜果腐霉的抑制效果,*,白灵菇菌糠堆肥提取液对恶疫霉的抑制效果 秸秆牛粪堆肥提取液对恶疫霉的抑制效果,*,白灵菇菌糠堆肥提取液对大丽花轮枝孢的抑制效果 秸秆牛粪堆肥提取液对大丽花轮枝孢的抑制效果,*,白灵菇菌糠堆肥提取液对瓜枝孢的抑制效果 秸秆牛粪堆肥提取液对瓜枝孢的抑制效果,*,白灵菇菌糠堆肥提取液对黄瓜枯萎病菌的抑制效果 秸秆牛粪堆肥提取液对黄瓜枯萎病菌的抑制效果,*,*,*,*,*,*,*,（1）基本理化性质的确定,研究内容及方法,一、堆肥提取液的成分分析,表1 堆肥及堆肥提取液的基本理化参数,*,以稀释涂平板法结合相应的筛选培养基对堆肥提取液中的有益微生物（细菌、放线菌、真

6、菌、木霉、曲霉、青霉、荧光假单胞菌）的数量进行测定。 例如：荧光假单胞菌能产生抗真菌的代谢物，抗生素和含铁细胞；,（2）微生物组成分析,*,徐大兵等，利用光谱技术（三维荧光光谱技术/3D-EEM、紫外可见吸收光谱/UV-Vis、傅里叶红外光谱/FTIR）、核磁共振技术（CP-MAS 13C NMR）对不同提取方式下提取液中的物质成分和结构进行了分析；以色谱技术（凝胶渗透色谱法/GPC)研究了物质分子量的分布；用高效液相色谱法（HPLC）对堆肥提取液中的有机酸（草酸、乙酸）含量进行测定； Teresa Carballo等，用傅里叶红外光谱（FTIR）和热分析技术（Thermal Analysis

7、）研究了两种不同腐熟程度堆肥提取液中的物质成分和结构的差异，并了解到提取过程中有机物质的转化；,（3）化学成分分析,*,温室盆栽实验,离体实验,观察堆肥提取液对病原真菌孢子萌发和菌丝生长的抑制效果。,人工接种病原真菌，以堆肥提取液灌根或叶面喷施，统计并计算发病指数和相对防效。,拮抗菌筛选及抑菌物质鉴定,二、抑菌活性研究,分离筛选对病原真菌有显著抑制作用的拮抗菌；通过LC-ESI-MS技术对菌株产生的抑菌活性物质进行鉴定。,*,平板拮抗实验，从堆肥提取液中分离出对灰霉和疫霉有显著抑制作用的拮抗菌（嗜氨基氨基杆菌、枯草芽孢杆菌、扩展短杆菌）；,拮抗菌的分离、筛选和抑菌活性物质的纯化、鉴定,将抑菌圈

8、处的琼脂块切下，制成冻干粉，利用反相HPLC和LC-ESI-MS技术鉴定出枯草芽孢杆菌产生的抗菌脂肽为：伊枯草菌素A（iturins A）、芬荠素（fengycin A）和表面活性素（surfactin）。,*,抑菌机理探讨：,（1）将浸提液高温灭菌或微孔过滤灭菌后，如果抑菌效果显著降低，则说明生防作用机理主要是提取液中的微生物同植物病原真菌的营养竞争作用；如果经过滤除菌或高温灭菌后，仍然存在抑菌效果，可以认为在堆肥提取液中存在某些特定微生物产生的抗生素类物质； （2）Yasmeen Siddiqui等，用堆肥浸提液处理感染了瓜笄霉的秋葵，发现植株体内与抗性有关的过氧化物酶、多酚氧化酶、苯丙氨

9、酸解氨酶活性提高，说明堆肥提取液能够诱导植物产生抗性； （3）EL-Masry等(2002)研究发现堆肥提取液中不存在抗生素或类似抗生素的物质,但检测到对真菌的细胞壁具有溶解作用的蛋白酶,脂肪酶,几丁质酶和-l,3-葡聚糖酶的存在。,*,三、促生活性研究,进行温室盆栽试验，研究喷施堆肥提取液对果蔬生长、产量和品质的影响。,表2 植株形态和生理测定指标,*,（1）Archana P. Pant等，用高效液相色谱电喷雾离子化串联质谱联用技术(HPLC-ESI-MS/MS)对堆肥提取物中的植物生长素及其代谢物进行了分析，在绿色废弃物高温堆肥中检测到了部分脱落酸和细胞分裂素（异戊烯基腺苷）的存在；在鸡

10、粪高温堆肥中发现了赤霉素GA4和GA34； （2）Keeling等研究发现与没有施用堆肥提取液处理相比,以腐熟的绿色固体废弃物为原料的堆肥提取液即使稀释12倍后仍然能够增加根系的生物量,他们认为这主要是由于提取液中腐殖酸的作用。Reeve等也认为堆肥提取液中具有类激素活性的腐殖酸具有促生效果。,促生机理探讨：,*,不同提取工艺猪 -稻轩堆肥提取液对黄瓜生长代谢的影响,技术路线,*,不同提取工艺猪 -稻轩堆肥提取液对黄瓜生长代谢的影响,以三种不同来源的农业固体废弃物堆肥（玉米秸秆堆肥、白灵菇菌糠堆肥、猪粪和牛粪堆肥）为原料，考察不同的提取工艺（好气或是厌气提取、不同的提取比例、提取时间）对其液态提取物生防和促生效果的影响； 平板抑菌试验针对48种常见病原真菌（黄瓜根腐病菌、黄瓜靶斑病菌、黄瓜霜霉病菌、番茄灰霉病菌、番茄炭疽病菌、草莓白粉病菌）考察其抑制效果； 温室盆栽试验主要针对1种常见果蔬病害进一步了解其防效;,*,不同提取工艺猪 -稻轩堆肥提取液对黄瓜生长代谢的影响,研究喷施堆肥提取液对常见温室蔬菜（黄瓜、番茄、草莓）生长、产量和品质的影响； 对其中有抑菌或促生活性的功能物质成分或核心微