凝胶层析操作过程(莫雯静).ppt

1、凝胶色谱工艺、莫氏-凝胶过滤技术、凝胶过滤技术主要为：(1)选择色谱介质(2)选择凝胶粒度(3)计算凝胶使用(4)选择凝胶处理(5)选择列(6)选择列(7)选择流化床(8)准备样品(9)相列()色谱柱的合理选择直接影响分离效果。选择色谱柱主要考虑分离成分相对分子质量的差异。(1)分离相对分子质量差异大的样品可以使用短粗色谱柱，如脱盐柱。列直径=10336901或20333001。(2)分离分子质量差异较小的样品，可以使用细长色谱柱、柱长(柱内径=50336901或100:1:分离蛋白质成分)。层分析柱介绍，1，普通色谱柱2，中压柱3，尼龙膜，色谱柱介绍，色谱柱是凝胶色谱的主体：工厂的单层柱，层

2、分析柱简，低压凝胶色谱柱，(2)柱，柱可分为湿装法和干装法两种将适量的溶剂放入柱中，粉碎空气，预先用溶剂浸泡的吸附剂将此悬浮液连续倒入柱中，自然沉降(柱的高度1/41/3)打开柱的下端口溶剂，柱顶部悬浮液下降到所需高度的干式装载方法。也就是说，将吸附剂直接添加到柱上，然后倒入溶剂。(湿安装方法适用于各种基质)、柱安装前，应注意在柱底部放置玻璃纤维或棉花层。色谱柱的矩阵必须符合均匀、均匀、无收缩气泡的标准，因此安装柱时吸附剂的表面必须平整，并始终浸泡在溶剂中，防止气泡或裂纹。(c)流动相选择在选择用于凝胶过滤的缓冲液时，考虑三个主要因素。(1)分离物质的稳定性：包括缓冲液的PH、离子强度和保护剂

3、。(2)凝胶介质的稳定性：没有介质和化学反应，不变形，不分解。(3)物质分离后处理：分离的成分经凝胶过滤分离后需要进一步分离时，使用与后续色谱方法相同的缓冲液。如果后处理为冷冻干燥，则可以选择挥发性溶液，例如HAC或NH4OH。(4)样品准备，样品通过离心、沉淀、提取等去除杂质，样品溶液的浓度不能太稀或太浓，成分不能太多。(5)相热，相热是将要分离的混合液添加到凝胶色谱柱中的过程。容出液的液体水平准确地放入凝胶床的表面和常时混合液，成分均匀地进入凝胶床。上柱的混合体积约为凝胶床体积的10%，最大不能超过30%。混合物的浓度可能更高，但粘度必须更低。(6)清洗，添加样品后，打开热流出口，将样品渗

4、透到凝胶床，样品水平与凝胶床表面相提并论，添加几毫升洗脱液清洗管壁，洗脱液必须与干凝胶膨胀时使用的液体完全一致，否则会影响分离效果。全部进入凝胶床后，连接单层床和洗脱液保管瓶及收集器，预先设计流速。一般来说，洗脱流速慢，分离效果好，但太慢，扩散恶化会影响分离效果。另外，洗脱时要严格控制流量。否则，收集的各部分洗脱体积不统一，很难用理想的分配技术来衡量。控制流速的最佳装置是恒流泵。流速对洗脱曲线峰形的影响及洗脱剂的流速对分离效果影响很大下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线，由此可以看出在快速流速下获得的洗脱峰宽低低流速下的洗脱峰窄高。也就是说，流速低，分辨率高。恒流泵，可以使用自静压加热装置(下面)获得恒定流速，更可靠的是微量恒流泵。没有恒流泵怎么办？没有恒流泵，可以使用控制工作压力的方法。工作压力由两个液面之间的距离控制。流速与工作压力相关，溶出流速与工作压力相关，凝胶模型也与粒度相关，在相同工作压力下，溶出编号较小的右旋糖酐凝胶和颗粒粗凝胶流速较大的情况较多。号码大，细流慢。对于某些凝胶，在一定范围内工作压力增大，流速加快。对于强度较大的凝胶(例如Sephadex G10到50)，流速(v)与工作压力(f)成正比，与柱长度(l)成反比。V=K P/L但是，对于强度低的凝胶，根据上述公