胶体金试纸条的制备

1、免疫胶体金技术简介，immune colloidal gold technique 2015-1-27。目录，胶体金技术开发，胶体金免疫层析技术(gold immunechromatograph IC assay，GICA)技术是胶体金技术与免疫层析技术相结合开发出来的，本质上是一种固体反应ELISA，使用胶体金来代替基质颜色。免疫胶体金技术是一种新的免疫标记技术，将胶体金作为追踪标记应用于抗原抗体。胶体金标记实质上是蛋白质等聚合物吸附在胶体金粒子表面的封装过程。胶体金技术开发，1939 -早期Kausche等将烟草花叶病毒吸附在金粒子上，用电子显微镜观察金离子的高电子密度。1971 -免疫组

2、织化学研究用Faulk等首先结合沙门氏菌抗血清和胶体金粒子，用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌表面抗原。1974 -间接免疫实现法Romano将胶体金显示在马恒者的IgG上，实现间接免疫金染色法。胶体金技术的种类和优点，快速免疫金渗滤(IGFA)是流动的固体膜免疫测定法。主要由膜渗色装置和标记粘结剂两部分组成。电子是填充有吸收物质的塑料小盒子，表面附着有抗体的硝酸纤维膜(用双抗体夹心法测定抗原等)，并将结合物标记为免疫金。a:金标记抗体b:样本的抗原c:封装抗体d: NC膜e:吸收材料f:塑料盒。免疫色谱(immunochromatogra-phy，ICA)是继IGFA之后开发的另一种固相膜免

3、疫测定法，与IGFA使用微极限膜的过滤性能不同，免疫色谱中滴落在膜的毛细管作用(基于色谱作用的横流在移动中，分析物与固定在薄膜特定区域的受体(抗原或抗体)结合固化。无关物质越过该区域分离，接着标记颜色以确定测试结果，以胶体金为标记的实验称为胶体金免疫层析试验。免疫胶体金技术的特点，优点：简单、快速，几分钟内就能得到结果；设备，操作员不需要特殊的培训。试剂稳定，适用于单个测量。无公害；GICA的特点是单一试剂在一个阶段工作。小型实验室是有条件的开发和生产。干燥包装用试剂在室温下可保存一年以上。现在已成为功耗测试(POCT)中广泛使用的方法。最近由于原料选择和制造工艺的改进，准备了可用于定量测定的

4、GICA试剂。Roche为诊断急性心肌梗死，生产与GICA试剂相匹配的简易读数装置Cardiac Reader，精度和准确度满足定量测定要求。不足：金免疫测定法是单一试剂，质量控制困难。同一批生产的试剂也很难保证各试剂的一致性。因此，金免疫测定一般只能用于定性测试。定量测试和灵敏度的增加取决于新原料和新材料的开发和应用。胶体金的合成，白磷还原法(1905年)能合成约3nm大小的金粒子；白磷还原法(1925年)得到了改进，可以合成5 12 nm大小的金粒子。抗坏血酸还原法(1958年)可以合成6 13 nm大小的金粒子；柠檬酸钠还原法(1973年)可以合成5nm，15nm，30nm，60nm大小

5、的金粒子。乙醇-超声波还原法(1980年)可以合成6 10 nm大小的金粒子；硼氢化钠还原法(1982)能合成金粒子的3-17n m大小。单宁酸-柠檬酸钠还原法(1985年)可以合成3 17n m大小的金粒子。胶体金合成，在200毫升锥形瓶中加入100毫升0.1% H2 aucl 4，放在搅拌电光炉中，加入磁条，加热至溶液沸腾。在沸腾溶液中获得1.5毫升0.1%的双水柠檬酸钠，Na3C6H5O7.2H2O深红色溶液时停止加热，常用柠檬酸3钠还原法制备胶体金测试条。胶体金的合成，注意事项(1)氯丁酸潮湿，应干燥、避光保存。(2)氯酸对金属有强烈的腐蚀性，制造氯酸水溶液时，不能用金属勺计量氯酸。(

6、。(3)用于制造胶体金的蒸馏水必须是双蒸馏水或3蒸馏水，或者是高质量的去离子水。(4)制造胶体金的玻璃容器必须绝对清洁，使用前要经过酸洗，用蒸馏水冲洗。圭化法最好在5%二氯硅烷的氯仿溶液中浸泡几分钟，用蒸馏水冲洗后干燥。胶体金的质量确认，高质量金粒子和劣质金粒子，不均匀的劣质金形状，非球形，聚集现象，颗粒间的变异系数很大。通过透射电子显微镜观察粒子的大小和均匀性，据说理想的金粒子基本上大小相同，没有均匀椭圆或多边形形状的金粒子。双电层结构确保胶体金的稳定性，使金粒子始终以悬浮状态存在。胶体金溶液通常由直径在1-1000米之间的单分散状态下的金粒子组成，稳定的金溶液要求金粒子在一定直径下保持不变

7、。蛋白质通常带有多种电荷，如果蛋白质带有正电荷，就可以与胶体金所具有的负电荷相互作用。蛋白质的疏水氨基酸可以通过疏水将蛋白质结合到金粒子表面。有些蛋白质可以通过半胱氨酸的巯基(巯基)，与金粒子共轭(金粒子)连接起来。胶体金的蛋白质标记，黄金标准样品程序，调整胶体金的准确pH值，最终结合(标记)纯化最低蛋白质含量，胶体金的正确pH值的调整，胶体金和蛋白质的结合是否成功取决于pH值，一般只在蛋白质等电点(PI)微元碱条件下牢固地结合，因此在标记前，必须调整为显示胶体金溶液pH值的蛋白质等电点尿分。需要提高胶体金的pH值时，可以使用0.1 molk 2 co 3；需要降低胶体金的pH值时，可以使用0

8、.1N HCl。金溶液的pH值会损坏pH值测量仪的探针，一般用精密pH测试条测定pH值即可。一般蛋白质标记条件，决定使用最低蛋白质，(1)光电比色法：制造不同浓度的各种当量蛋白质溶液(1 ml)，分别加入5ml胶体金(1ml)，快速混合，加入1ml 10% NaCl溶液，摇晃，保持5min不动根据胶体金粒子的大小，OD在520580nm之间测量，以ODS值为纵坐标，蛋白质使用量以横坐标为曲线，曲线最先接近横轴的点上蛋白质使用量最稳定。图中10nm胶体金溶液中蛋白质的最佳稳定性为45g/ml。(2)视觉检测法：确定胶体金与标记蛋白的使用比例，逐步稀释所标记的蛋白质(5 g 45 g单独作为对照组

9、)，在一系列带1ml胶体金的试管中添加等价物顺序，5min后，在上述各管中分别添加0.1ml 10%氯化钠，按表顺序进行，1，2号管子上出现了黑色沉淀，红色都希望。3号管也能保持红色，但管底也出现了一定量的黑色沉淀，4、5号管颜色没有变化。与对照组颜色一致，最低蛋白质量为4号管的蛋白质量。在McAb(最终结合)，100毫升金溶液，pH值调整为8.2的过滤和离心抗体溶液(0.1g/l)中，pH8.2金溶液快速搅动时，加入定量抗体(蛋白质最小浓度加10%)，然后在金标准溶液中过滤约5分钟，精制、超速离心、凝胶过滤、几种免疫金探针离心精制条件、胶体金免疫层析试剂的组成，样品垫：玻璃纤维、聚酯薄膜、纤

10、维素滤纸、非织造布等多种材料，多种规格，布局间稳定性。样品垫的作用：有助于减缓样品渗透速度，样品均匀分布在组合垫上；从样品中去除杂质粒子。调整样品液体pH值或粘度等。样品垫可以在浸渍处理中使用化学物质，减少样品差异，提高测试灵敏度。一般情况下，将洗涤剂、粘性强化剂、阻断剂、盐渗入样品垫进行干燥，避免了使用复杂的识别剂/跟踪缓冲液的麻烦，是一步完成测试的过程。结合垫：玻璃纤维、聚酯薄膜、纤维素滤纸、非织造布等多种材料，各种规格，布局间稳定。结合垫的作用主要如下：-吸附一定量的金标准结合粒子；-在NC膜上吸附和持续传递样品；-维持金标准粘结剂颗粒的稳定性；-毛利标准粘结剂颗粒定量完全释放等。玻璃纤

11、维膜/聚酯纤维膜，硝化纤维素膜：通常采用国外企业的硝酸纤维素膜，如Millipore、MDI、SS、whatman。NC膜的作用：-抗体固定在检查线和对照线区域；-样品在NC膜中流动，与试剂混合，产生免疫反应；-读取对NC膜的反应颜色、检查结果NC膜的重要参数：光圈、对称、色谱速度、表面活性剂、蛋白质结合力、强度、表面质量、厚度、放置均匀性等。硝酸纤维膜选择，膜分类标准(m和s) m:膜孔径转换约8m=135s；6m=180s的不同时间(秒)的膜对反应的影响更快地通过，包在t线中的物质的反应时间也更短，读数更快的灵敏度也更低。相反，反应时间长，读数慢，灵敏度高。另一个问题是反应时间越长，出现非

12、特异性结合的可能性就越大，所以长时间反应不一定能提高灵敏度。135s通常用于双抗体夹心法，180s通常用于竞争法。板材：不干燥塑料基板，板材的质量对产品的保质期有很大影响。吸水剂：提供高吸水率、高容量和相对稳定的吸水率的吸水纸；吸水纸的作用：主要作用是调节样品的流速，促进虹吸管作用，通过试剂，不仅仅是胶片。胶体金免疫层析试纸模式，双抗体夹心模式疾病抗原检测竞争模式小分子物质检测spa/蛋白g模式疾病抗体检测。双抗体夹心模式，竞争模式，spa/g蛋白模式，胶体金免疫层析试纸条质量检测，胶体金免疫层析试纸的应用、在兽药残留检测中用肠道等clent准备的单克隆抗体标记胶体金作为检测探针，然后将BSA结合的crent row组装成t型线，以竞争模式组装成试纸，为样品中使用的clent-lent检查残留提供了有效的工具，供我国食品安全检测使用。随后，张队以同样的方式准备了两种兽药残留测试条，组装了磺胺二甲嘧啶、恩诺沙星残留检测胶体金免疫层析测试条，为我国兽药残留快速检测技术的发展奠定了基础。在兽医疾病检测中应用Bhakar等，应用相应的单项金，制定了阿米巴抗原检测方法。为检测牛病毒腹泻抗原，用Kameyama等牛病毒腹泻病毒的NS3蛋白制造单克隆抗体，用胶体金标记制造单克隆黄金测试条。康等