分子生物学实验.ppt

1、分子生物学实验，实验目录，碱分解法少量质粒DNA 2.诱导细胞调制3 .质粒转化4 .聚合酶连锁反应(PCR )，实验1，碱改性法少量质粒DNA，1，实验目的，碱分解法提取质粒的方法，2，实验原理， 掌握质粒DNA的分离方法，碱改性法煮沸法SDS法羟基磷灰石色谱法等各种方法的分离可根据宿主菌株的种类、质粒分子的大小、碱组成和结构等特征进行选择，其中碱改性法经济，收获率高，提取的正可以用于连接和转化的碱改性法的基本原理，在pH 12.0-12.6的碱环境中，线性大分子量细菌染色体DNA的改性，共享闭环质粒DNA在自然状态下将PH调节为中性，在高盐浓度的存在下，染色体DNA彼此交联形成不溶性的网状

2、结构， 大部分的DNA和蛋白质在除污剂SDS的作用下沉淀，质粒DNA仍处于可溶状态，可通过离心去除细胞的碎片、染色体DNA、RNA和大部分蛋白质，质粒DNA还在上清中的酚氯仿提取中提取质粒DNA 进一步精制实验试剂LB培养基：色氨酸10g酵母提取物1000ml的ph 7.5 NaCl 10s te:0.1 mnacl 10 mmtrishcl (ph 8.0 )1mmedtaamp 50m g/ml溶菌酶10 mg/ml (10 mmtri 溶液: 50mM葡萄糖25mM TrisHCl(pH8.0) 10mM EDTA溶液ii:(新鲜制备) 0.2N NaOH 1% SDS溶液iii:5ka

3、c10ml冰醋酸11.5ml水28.5ml苯酚， 氯仿乙醇RNase琼脂糖TE: 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM EDTA，4、实验方法、1 .将琼脂培养板上的单一菌落采集到5ml LB培养液中(包含AmP 50g/ml )，在37下强烈摇动的1.5ml培养液进行EPP 以12000g离心30秒，丢弃上清用ste悬浮菌体，进一步离心回收菌体，一次丢弃上清，去除沉淀，在100l预冷溶液I中沉淀悬浮3 .细菌，振荡混合，在冰上放置5分钟，加入4、实验方法、200l溶液ii，减轻盖在冰上放置5分钟，加入150l溶液iii，温和地振荡数次，在冰上放置5分钟，在6.12000g 4 下

4、离心5分钟，取上清，转移到一个新的Eppendorf管中，加入7 .等量酚/氯仿(1:1)，振荡混合，1 将上清转移到另一个Eppendorf管中，加入8.2倍体积的无水乙醇，振荡混合，在室温下静置2分钟。 9.12000g，在4 下离心5分钟。 10 .丢弃上清，加入70%乙醇1ml漂洗沉淀，使盖子翻转数圈，在12000g 4 下离心2分钟。 11 .扔掉上清，提取乙醇，在室温下干燥(5-15分钟)。 加入12.50te (含有20g/ml的rna酶，不含DNA酶)溶解DNA。 用TE将13.10l的DNA溶液稀释成1000ul，测定OD260和OD280，计算OD260/OD2 80之比1

5、4。 同时，在稀释倍数od2600.0550/1.5ml15.10l的DNA溶液中加入2l的加载缓冲器，计算1%琼脂糖、电泳3小时、电压40v。16 .电泳凝胶用透射型紫外线检测器的观察、结果的记录、5、实验结果的分析、1 .基于质粒DNA OD260、OD280的值计算质粒DNA的取得率和DNA纯度2 .记录电泳结果，说明结果内容、6、思考问题、1 .溶液I、溶液实验中分别加入上述溶液后反应体系的出现现象及其成因2 .简要叙述了苯酚氯仿提取DNA体系后出现的现象及其成因，实验2、大肠菌受体细胞的制备、实验目的、氯化钙法制备大肠菌受体细胞的方法、实验原理， 受体状态：细菌能吸收外来DNA的生理

6、状态是，感染体细菌用低渗透氯化钙处理后，细胞的膨胀、细胞膜的透过性发生变化，成为能够允许外来DNA分子通过的状态的本实验，以E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌，成为诱导状态。 超清洁台、台式高速冷冻离心机、恒温空气摇床、实验试剂、大肠菌DH5 LB培养基、0.1mol/LCaCl2溶液(预冷)、实验顺序菌株活化受体细胞的制备、实验工序、菌株活化1 .直接采集在接种环冷冻保存的大肠菌DH5，在LB培养基平板表面划线在37下取16小时2 .单个菌落，转移到3-5mlLB培养基中，37下3-5小时3 .培养液全部转移到100mlLB培养基中，2-3小时，OD600=0.3-0

7、.4受体细胞的制备4 .培养液转移到1.5ml远心管中，在冰上15-30 ml 舍弃上清加入0.3ml预冷的0.1mol/l CaCl2，悬浮沉淀，在冰上以10min 7.4000rpm离心5 min上清加入含有0.2ml预冷甘油的0.1mol/l的cacl2，悬浮沉淀是诱导细胞，可以在-70的长期保存1 .经常制造诱导细胞的大肠菌是什么？2 .第8步骤氯化钙溶液中甘油的作用是什么？实验3、氯化钙诱导质粒转化， 实验目的1 .了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义2 .学习将外源质粒DNA移植到受体菌细胞中筛选转化体的方法，将外源DNA分子导入受体细胞，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段

8、是微生物遗传、分子遗传， 基因工程等研究的基本实验技术，常用转化方法，电击法CaCl2、RuCl等化学试剂法的实验原理，本实验以E.coli DH5菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌，加入pucch18质粒， 在钙离子的作用下，质粒和钙离子形成复合体并吸附在细菌细胞表面，42的暂时热刺激可增大细胞膜透过性，吸收吸附的质粒DNA，即可实现转化，实验原理，pucch18质粒具有氨苄西林耐性基因用含氨苄西林的平板培养基培养转化的受体细胞，只有转化体能够生存，但没有转化的受体细胞因为没有抵抗氨苄西林的能力而死亡，抗Amp，宿主细菌，含Amp的培养基，影响转化率的因素， 细胞的生长状态和密度转化质粒

9、DNA质量， 浓度试剂的质量是防止杂菌和其他外来DNA污染的实验器具、超洁净台、台式高速冷冻离心机、恒温空气摇床、恒温培养箱、培养皿、实验试剂、诱导细胞大肠菌DH5 LB培养基、0.1mol/LCaCl2溶液(预冷)氨苄西林puc 1 .将目标DNA加入大肠菌诱导细胞，在冰上30min2.42水浴90S 3.在冰上2min4.lb，在37下培养1小时，实验工序，在5. 3000rpm下吸入2min 6.上清液0.8ml，轻轻吸收剩下的液体， 均匀7 .将培养液均匀涂在含有Amp的培养基平板上8 .将平板放入37的恒温培养箱中培养12-14小时，观察结果，对照组1:用同体积无菌双蒸洒水代替DNA

10、溶液，其他操作与上述相同。该组在正常情况下，应该在含有抗生素的LB平板上不出现菌落，对照组2:用相同体积的无菌双蒸洒水代替DNA溶液，涂板时在不含抗生素的LB平板上只涂5l菌液，该组在正常情况下应产生大量菌落转化后在含有抗生素的平板上生长的菌落是转化子，可以根据盘子中的菌落数计算出转化子总数和转化频率的转化子总数=菌落数稀释倍数转化反应原液总体积/涂板菌液体积转换频率(每个转化子数/mg质粒DNA 质粒DNA添加量(mg )，诱导细胞总数=对照组2菌落数稀释倍数菌液总体积/涂板菌液体积诱导细胞转化效率=转化子总数/诱导细胞总数，实验结果分子生物学中常用的载体有哪些实验步骤，第4阶段加入lb液体

11、培养，在37下培养1小时的作用实验四聚合酶链反应(PCR )、实验目的、通过本实验学习PCR反应的基本原理和实验技术、实验原理、聚合酶链反应(PCR )，是体外快速扩增特定基因和DNA序列的方法经过改性、退火和几个循环，被放大的DNA片段的两侧和其两侧互补的寡核苷酸引物，DNA被放大2n倍。 PCR技术的原理，1 .改性：在加热或碱性条件下切断DNA双螺旋的氢键，形成单链DNA，改性2 .称为退火：铸模和底漆的复原性。 引物是与模板的某一区域序列互补的DNA片段3 .延伸：以与特定DNA模板结合的引物为起点，以4种脱氧核苷酸为碱基对的形式沿53的方向沿模板合成新的DNA链，1 .引物2. 4种色氨酸3. Mg2 4 .模板5. Taq DNA聚合酶6 .反应缓冲液PCR反应中的主要成分、实验设备、电泳器、琼脂糖凝胶电泳槽、PCR器、凝胶成像系统、移液管、实验材料、1、DNA模板2、4种dNTP 3、普拉琼脂糖凝胶6、DNA相对分子质量标准物7、芯片、50ul PCR管、试剂10PCR缓冲液(包括Mg2 ) 4d NTP (分别为1mmol) Tag酶1U/ul DNA模板引物1: -ggggagagattcatggtgagagagag 底漆2: