酶的生产方法.ppt

1、酶生产，酶生产方法；酶生物合成的基本理论；发酵酶生产工艺条件及控制；酶发酵动力学；固定化细胞及原生质体发酵产酶、产酶方法，1894年，由于美国国籍最高峰，吉首先从曲霉制取最高淀粉酶(a-淀粉酶，转氨酶)，并将其用作消化剂，为现代酶的生产和应用开创了先例。1908年，德国罗马(Rohm)用动物胰腺制造胰蛋白酶，目的是软化皮革。1908年，法国的博丁为纤维制造了细菌淀粉酶。1911年，沃勒斯坦从木瓜中获得了用于净化啤酒的木瓜。1949年，日本开始用微生物液体深层培养法发酵生产细菌a-淀粉酶，揭开了现代酶准备产业的序幕。20世纪80年代发展的移动植物细胞培养技术继微生物发酵生产酶后，成为酶生产的另一

2、种方法。1节酶生产方法，1，酶生产方法，1，使用多种技术移动，从植物细胞或组织中直接提取酶。提取简单易行，但受到原料来源的限制。2，化学合成法是20世纪60年代中期出现的新技术。只能合成已知化学结构的酶。成本比较高。仍停留在实验室内合成的阶段。牛胃 chymase胰腺胰酶血凝血酶木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶，3，微生物发酵法是20世纪50年代以来产生酶的主要方法。利用微生物细胞的生命活动合成所需酶的方法称为发酵法。酶发酵生产是目前酶生产的主要方法。第二，开发酶的微生物的优点1，多种微生物，丰富的酶；2，微生物快速生长繁殖，容易提取酶，尤其是细胞外酶；3、微生物培养基广泛，价格低廉；4、可利用微机等新技

3、术控制酶发酵生产工艺；5，利用基于基因工程的现代分子生物学技术选育菌株，提高酶的产量和开发新酶。第三，酶发酵生产类型，1，液体深层发酵：液体培养基，灭菌，冷却后，访问酶生产细胞，特定条件发酵。2、固体培养发酵培养基以麦麸、米糠等为主要原料，灭菌后连接酶产生菌，在一定条件下发酵。3、固定化细胞发酵(70年代后期开发)细胞固定在载体上，然后进行发酵生产。固定化原生质体发酵(80年代中期开发)原生质体是指去除细胞壁的微生物细胞或植物细胞。第二节酶生物合成的基本理论，第一，酶生物合成过程，DNA，RNA，蛋白质(新生多肽链)，成熟蛋白质(酶)，细胞内，细胞外，转录，翻译，例如：乳糖诱导-半乳糖苷酶合成

4、淀粉诱导合成a-淀粉酶，2，酶合成抑制，(1)最终产物抑制酶催化反应的产物，或代谢途径的末端产物，产生抑制该酶生物合成的现象。(2)分解代谢物质抑制(营养源抑制)是指某些物质分解代谢产生的物质阻碍其他酶合成的现象。葡萄糖抑制-半乳糖苷酶的生物合成，果糖抑制a-淀粉酶的生物合成，A1 B1，A2 B2，E，在色氨酸过量服用时，抑制催化色氨酸合成的相关酶。第三节微生物发酵产酶工艺(重点)、发酵法为产酶菌株提供适当的营养和生长环境，在产菌大幅度增殖的同时，合成所需的酶，从发酵物质制酶产品。通过深层液体发酵大规模生产现代酶制剂。，无论是什么发酵方法，都要进行三项工作：(1)从原料中准备培养基；(2)从

5、原菌株制备生产菌株；(3)发酵过程管理。第一，发酵酶生产的一般过程，原材料 原种 麦麸和其他原料 85蛋糕餐和其他原料淀粉原料试管斜面培养(活化)准备培养基85 淀粉糖浆 发酵罐(液体发酵) 发酵池(固体发酵)准备培养基培养发酵液 成品歌 85允下游加工液体酶制剂 (3)产酶稳定性好，不易退化，不易感染。(4)使用廉价原料，易于开发和管理；(5)安全可靠的非病原菌。新开发的酶包括：(2)以下表格中列出的检验，常用的酶生产微生物，1，细菌大肠杆菌产脱羧酶，天冬氨酸，青霉素酰化酶，天冬酰胺酶，-半乳糖苷酶，限制性核酸内切酶，DNA聚合酶，DNA，枯草芽孢杆菌-淀粉酶，蛋白酶，-葡聚糖酶，5-核苷酸

6、酶，碱性磷酸酶。2，放线菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、几丁质酶等。3，真菌曲霉：葡萄糖淀粉酶、-淀粉酶、酸性蛋白、果胶酶、葡萄糖氧化酶、双氧水酶、核糖核酸酶、橙皮苷酶等。米曲霉：氨基酰化酶、磷酸二酯酶、果胶酶等。红曲：-淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶等。青霉：葡萄糖氧化酶、苯氧甲基青霉素酰化酶、纤维素酶等。木霉：纤维素酶。根霉：葡萄糖淀粉酶、蔗糖酶、碱性蛋白酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、纤维素酶等。毛霉：蛋白酶、糖化酶、-淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、凝胶酶等。4，酵母啤酒酵母：丙酮酸脱羧酶、酒精脱氢酶等。假丝酵母：脂肪酶、尿酸酶、尿囊产酶、转基因酶、酒精脱氢酶

7、等。工业规模的微生物酶及其特定来源，工业规模的微生物酶及其特定来源，工业规模的微生物酶及其特定来源，(c)产生菌的来源，(1)购买，专利要求菌种保存机构筛选所需菌株。中国工业微生物菌种保存中心(CICC)；中国典型的培养保存中心(CCTCC，又称舞台保存中心)。中国农业微生物菌种保存中心(accc)；中国普通微生物菌种保存管理中心(CGMCC)美国典型微生物菌种保存中心(ATCC)荷兰微生物菌种保存中心(CBS)德国微生物菌种保存中心(DSMZ)英国国家典型菌种保存中心(NCTC)，(1)抽样：主要，酶产生菌筛选阶段：2，筛选从土壤、水、动植物等自然中提取样品，进行分离筛选。(2)初级体：产生

8、靶酶的菌株的分离；给出特定的培养基或培养条件，结果目的菌株繁殖，尽可能分离出只属于目的菌株的菌株。，-淀粉酶筛选，蛋白酶筛选，(3)筛选：筛选结果菌株中优良菌株；根据初级体质筛选酶产量高、性能更适合生产要求的菌株。诱变育种细胞杂交原生质体融合育种基因工程育种，(4)高产菌株的选育。(4)生产酶种类的保存，保存方法：倾斜保存法，砂质保存法，真空冷冻干燥保存法。低温保存法，石巴油保存法等。(5)生产种子的制造，生产种子：由原始保存菌激活，扩大培养，接种发酵罐的大量菌丝体。1，种子准备过程，(1)物种激活，目的：保存的菌株在用于发酵生产前必须接种鲜斜培养基，在一定条件下培养，恢复细胞的生命活动能力。

9、方法：在试管坡培养1-3代。(2)扩张培养，目的：活化菌株从一级扩展到数级，以便获得足够的优质细胞。徽章称为种子徽章。方法：分为实验室培养和车间训练两个阶段。扩大培养中应注意的事项：(1)减少纵酒，将污染可能性降到最低。(2)培养基成分一般应比发酵培养基中的氮源丰富。(3)培养时间一般控制微生物生长的大生器官，及时接近下一阶段的培养或发酵期。(4)严格控制培养条件(pH、温度、通风量等)，加强培养过程的实时监控。第三，培养基，1，碳源：提供碳元素；能量。碳源，氮源，无机盐，生长因素，水等。来源：淀粉和水解物-淀粉水解糖、糖蜜、或大米、土豆、玉米、麦麸、米糠等含淀粉原料。此外，石油产品中12碳-

10、16碳的碳氢化合物成功地用作微生物培养基的碳源。注：选择碳源时，应尽量选择具有降解代谢抑制效果的碳源，或不使用具有所需酶诱导效果的碳源。培养基是为微生物生长、繁殖和合成酶人工制造的营养物质的混合物。2，氮源：提供氮元素。资料来源：有机氮：使用农产品种子的副产品，如豆饼、花生酱、面包等；无机氮：含氮无机化合物(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3和(NH4)3PO4等。3，无机盐：大量元素和微量元素。基本功能：构成细胞的成分；构成酶产品的成分；作为酶活化剂。4，生长因子，指微生物生长和繁殖所必需的微量有机物质。主要由各种氨基酸、嘌呤或吡啶、维生素等三种物质组成。酶制剂中使用的生长因子大部分

11、是天然原料，如玉米浆、麦芽、豆芽汁、麦麸、米糠、酵奶油等。5，水、准备培养基的注意事项：(1)培养基碳氮比是培养基成分比例的重点；(2)碳源和氮源的选择应避免碳分解代谢抑制和氮分解代谢抑制。(3)培养基中无机盐的选择应注意盐引起的生理酸碱反应；(4)发酵生产中使用的培养基成分比例不能轻易改变。微生物发酵产酶培养基实例，1，枯草杆菌bf7658 a-淀粉酶发酵培养基：玉米粉8%豆粉4%磷酸二钠0.8%硫酸铵0.4%氯化钙0.2%氯化铵0.15%天然pH，2，2，种子培养基：用于菌种的生长和繁殖。3，发酵培养：用于菌种的生长、繁殖和发酵产物的合成。第四，发酵条件控制影响酶生产的几个重要条件，第一，

12、温度控制控制，(2)部分微生物生长最佳温度不同于发酵酶生产最佳温度。例如：曲霉酱油生产蛋白酶，28 的蛋白酶产量为40 的24倍，20 发酵的话蛋白酶产量更高，但细胞增长率更慢。为此，部分酶在发酵生产过程中，在不同的发酵阶段调节不同的温度。即在微生物生长阶段控制生长的最佳温度范围，在酶生产阶段控制酶生产最佳温度范围。(1)不同微生物的最佳生长温度不同。(3)温度控制方法，一般为热水加热，冷水冷却。因此，发酵罐有足够的传热区域，如管道、蛇管、夹克和洒水装置。2，pH调整控制，(1)根据最适合生长和繁殖的pH值不同的微生物。(2)微生物生长的最佳pH值与产酶最佳pH值经常不同。(3)某些微生物可以

13、同时产生多种酶，在生产过程中，通过调节培养基的pH值，常常可以改变多种酶之间的产率。黑曲霉-淀粉酶pH中性，(4) pH值的影响因素，一般培养基成分中C/N比例高，发酵液倾向于酸性，pH值低；C/N比率低，发酵液呈碱性，pH高的趋势。其他盐的使用也影响pH。(5)生产过程中pH值控制方法，添加缓冲液以保持一定的pH值(如磷酸盐)；调节培养基的原始pH值，保持一定的C/N比例。发酵液的pH值太高，添加糖或淀粉进行调节。相反，添加尿素或液氨。PH值也与通风有关。通过调节通风；酸，碱。3，溶解氧控制，溶解氧是指溶解在培养基中的氧气。微生物一般只利用溶解氧。溶解氧速度调节方法，(1)通风调节；(2)调

14、节氧气的分压。(3)气液接触时间调节；(4)气液接触面积调整；(5)改变培养液的性质。5，调节湿度，用固体培养基生产酶制剂，一般初始湿度低，培养后期湿度，有利于酶的生产。4，泡沫，形成：通气混合，培养基特定成分的变化，代谢生成气体。危险：阻碍二氧化碳的排除，影响氧气的溶解。引起感染菌。包裹方法：机械包裹，化学包裹。第五，提高酶生产的措施，(a)增加诱导酶发酵生产，添加酶合成诱导剂，可以大大提高酶生产。1，不同的酶各有不同的衍生物；但是有时一种衍生物有多种酶可以诱导产生相同的酶。同一种酶经常有多种诱导剂。3，衍生物浓度：应以适当浓度控制。2，衍生物分类(1)酶底物；(2)酶基质类似物；(3)酶反应产物；(4)气质和气质类似物的前体。(b)抑制剂浓度，1，最终产物抑制方法，培养基中酶活性产物浓度降低；添加最终产物的类似物。2，通过分解代谢产物抑制方法、培养基中的葡萄糖等易于使用的碳源浓度调节、淀粉等其他难以使用的碳源使用，或者通过补充剂、子流程、碳源添加等方法，在