植物原生质体融合技术

1、第十六章植物原生质体融合什么基本原理为什么技术应用如何技术，微丝、叶绿体、线粒体、质膜、囊泡、细胞核、内质网、微管、细胞壁、高尔基体、植物细胞模式。细胞壁由三种主要成分组成：纤维素25-50%、半纤维素53%和果胶5%。什么基本原理，去除植物细胞壁获得大量原生质体诱导原生质体融合形成杂种细胞筛选、培养、促进杂种细胞分裂和分化从细胞团、愈伤组织到最终植株形成。为什么要应用技术，植物原生质体融合的意义：克服种属以上植物有性杂交的不相容性障碍为携带外源遗传物质的大分子进入细胞创造条件。技术方法如何，第十六章植物原生质体融合技术，植物原生质体培养的制备，植物原生质体融合，1。植物原生质体的制备，原生质

2、体的概念和培养的意义。从原生质体材料中分离纯化原生质体。1.原生质体的概念和文化的意义。概念：从植物细胞壁上去除裸细胞，称为原生质体意义：(1)植物原生质体具有再生完整植物的能力。(2)为细胞融合的研究提供了可能。生产新的杂交品种是可能的。(3)细胞壁被去除，这降低了细胞的脱氧核糖核酸酶活性，从而促进了外源脱氧核糖核酸的进入。为新性状植株的再生提供了有利条件。(4)是开展遗传学理论研究的材料。植物原生质体在理论研究和细胞工程中的地位，信息传递和能量转换的细胞壁合成机制，膜结构和功能的机制，细胞间杂交或自交不亲和的机制，植物激素的机制，体细胞杂种的融合，各种细胞器的分离，各种细胞器的引入和外源基

3、因的引入以诱导突变体。原生质体材料的来源，植物叶片-容易获得的材料-更容易通过酶水解分离植物根尖组织-植物花粉可以从各种植物的种子发芽后获得-单倍体原生质体愈伤组织可以产生，细胞悬浮培养-细胞壁容易解离。3。原生质体分离。原生质体分离法，机械分离法在高渗溶液中预处理细胞，直到细胞有轻微的质壁。优点：该方法可以避免酶制剂对原生质体的破坏。缺点：获得的完整原生质体数量相对较少。酶分离中常用的细胞壁降解酶包括纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、果酸酶等。它可以获得大量的原生质体，而且几乎所有的植物或它们的器官、组织或细胞都可以通过酶水解获得原生质体。缺点：酶制剂含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶和酚类。影响获

4、得的原生质体的活力。影响原生质体数量和活力的因素：1)不同植物或不同组织和细胞的细胞壁组成和结构不同2)渗透压稳定剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖、葡萄糖、盐(KCl、硫酸镁、水)等。3)质膜稳定剂：如硫酸葡聚糖钾、氯化钙、磷酸二氢钾等。增加质膜的稳定性。4)酶溶液的酸碱度：一般为5.4-6.0 5)温度因素。6)植物材料的生理状态：如植物年龄、发育状态、栽培条件等。对材料选择有很大影响。烟草悬浮细胞：2%海藻糖酶纤维素酶2%纤维素酶纤维素酶0.5%果胶酶；海水。胡萝卜悬浮培养细胞：2%红小豆纤维素酶0.5%干燥酶0.5%半纤维素酶1%果胶酶；0.35毫升甘露醇0.35毫升山梨醇白菜根细胞等。4%纤维

5、素酶2%半纤维素酶0.3%果胶酶；0.7M甘露醇。番茄无菌苗的子叶和叶肉细胞：1.5%纤维素酶0.3%果胶酶；102.6克/升蔗糖。水稻种子愈伤组织悬浮培养细胞：2%红小豆纤维素酶1%干燥酶纤维素酶2%马其顿酶R-10果胶酶1%果胶酶；0.3M葡萄糖，4、原生质体纯化，除去杂质如破碎的原生质体、无壁细胞、细胞器和其它碎片，a、过滤方法b、漂浮方法c、离心方法，实施例：烟草叶肉细胞原生质体分离，1)。材料准备和消毒：2)。酶解：3)。净化：4)选择在温室中生长了大约两个月的烟草植物，从健康植物中采摘完全发育的幼叶，用自来水冲洗，放入70%乙醇中进行表面消毒，然后放入2%次氯酸钠溶液中处理10分钟

6、，然后用无菌水冲洗3-4次，以完全去除消毒剂；2)酶解，用一把锋利的镊子小心地将叶子的下表皮撕掉，切成2厘米长的小块，然后放入含酶溶液中进行处理(注意：将去皮的一面朝下，在25 28下进行酶解反应3 4小时，轻轻摇动培养皿几次)，3)纯化，将酶解悬浮液过300 400目筛，除去未消化的大块碎片， 然后将含有原生质体的酶溶液收集在离心管中，低速离心，使原生质体沉入管底，并将上清液倒入离心管中。 重复此步骤3次，以完全去除酶解产物；最后用原生质体培养液离心一次，分离、洗涤和纯化原生质体试剂，分离、洗涤和纯化试剂kh2po4 27.2mg kno3 101mg氯化钙2h2o 1480mg硫酸镁7h2

7、o 240mg ki 0.16mg硫酸铜5h2o 0.025mg甘露醇13%纤维素酶4%果胶酶0.4%蔗糖- 21% pH 5.6 5.6 5.6，与分离试剂相同，与分离试剂相同；4)原生质体活力的测定：将形态完整、细胞质丰富、颜色鲜亮的原生质体释放到渗透压浓度降低的洗涤液或培养基中，可以看到分离后，被还原的原生质体将恢复到原来的状态，成为正常膨胀的、通常是活性的原生质体。染色方法：用0.1%的酚藏红花溶液染色，活原生质体可用荧光素二乙酸酯染色，在荧光显微镜下观察到有荧光的原生质体是有活性的。根据美国食品和药物管理局方法的原理，美国食品和药物管理局本身没有极性，不能发出荧光，可以自由进出细胞膜

8、。在活细胞中，食品和药物管理局被酯酶切割，释放极性荧光素。荧光素不能自由穿过质膜并在活细胞中积累。荧光素不能在死细胞中积累。在紫外线照射下，活细胞中的荧光素发出绿色荧光。请想一想，活细胞和死细胞，美国食品和药物管理局首先用丙酮配制了0.5%的母液，最终浓度为0.01%。原生质体分离和纯化流程图，第16章植物原生质体融合技术，植物原生质体制备，植物原生质体培养，植物原生质体融合，2。植物原生质体培养，1。原生质体培养法。原生质体培养程序。原生质体培养成功的关键技术，是固体培养法，根据一定的细胞初始密度，在薄层固体培养基中均匀分布。该方法的优点是有利于定点观察单个原生质体细胞团形成和细胞壁再生的全

9、过程。浅层液体培养法：将3 4毫升原生质体培养液注入培养皿或三角瓶中，然后注入纯原生质体，按一定细胞密度培养。在固体培养基上，加入适合原生质体细胞壁再生和细胞分裂的液体培养基。1.原生质体培养法。原生质体培养程序，细胞壁再生：体积扩大，叶绿体重新排列，新的细胞壁开始合成，细胞从球形变成椭圆形。细胞分裂形成细胞团：通常，在培养2-3天后，细胞质增加，细胞器增殖，DNA和蛋白质合成增加，细胞分裂，形成小细胞团，并发展成愈伤组织或胚状体。器官形成和植物再生：胚状体发育是由愈伤组织诱导的。3。原生质体培养成功的关键技术和影响原生质体活力的因素：原生质体的制备方法、渗透压稳定剂的种类和浓度、质膜稳定剂的

10、种类和浓度、温度和保温时间。原生质体密度的初始密度一般为104-105个细胞/毫升。细胞壁再生速度、植物种类和材料的生理状态；细胞培养的时期；原生质体培养环境：光照、温度、湿度，第16章植物原生质体融合，植物原生质体培养的制备，植物原生质体融合，综述：动物细胞融合技术介绍，亲本来源，融合方法，融合细胞的筛选，融合细胞的克隆，融合细胞的鉴定，3。植物原生质体融合，1。植物细胞融合的概念和意义。植物细胞融合程序。诱导细胞融合的方法和融合剂。细胞融合的影响因素。细胞杂种的选择和鉴定，1。植物细胞融合的概念和意义，细胞融合的概念：也称为细胞杂交：在体外以无性方式将不同细胞人工融合成杂交细胞的技术。细胞

11、融合的意义：克服种属以上植物的有性杂交不亲和性障碍，为携带外源遗传物质的大分子进入细胞创造条件。2。植物细胞融合的程序，原生质体分离的分离和纯化，融合方法的选择，杂种细胞的筛选，愈伤组织形成，器官分化，植物再生，杂种植物的鉴定。3。诱导原生质体融合的方法和融合剂盐融合法高钙高酸碱度融合法聚乙二醇融合法聚乙二醇结合高钙高酸碱度融合法电融合法，综述：诱导动物细胞融合的方法，1。病毒诱导的细胞融合2。化学融合剂诱导细胞融合3。电融合法，a .盐融合法，盐融合剂硝酸盐：亚硝酸钠，硝酸钾，氯化钙：氯化钠，氯化钙，氯化镁，氯化钡葡聚糖硫酸盐：葡聚糖硫酸钾，葡聚糖硫酸钠盐优缺点：盐融合剂对原生质体活力的破坏

12、能力小缺点：融合频率低，不易诱导融合到液泡化原生质体中加入0.05毫升/毫升二氧化氯和0.4毫升/升甘露醇；用甘氨酸钠缓冲溶液的酸碱度至10.5，形成融合液，在37下保温0.5小时；用0.4毫升甘露醇清洗高氯化钙和高酸碱度；两种原生质体的融合率达到10%。聚乙二醇是一种分子量为200-20000的高分子化合物。融合机制可能是由于带有大量负电荷的聚乙二醇分子与钙离子连接下的原生质体表面负电荷之间形成静电键，促进异质原生质体之间的粘附，然后用培养基缓慢稀释聚乙二醇，最后洗去聚乙二醇，得到10%的异核体。聚乙二醇结合高钙和高酸碱度，先用聚乙二醇处理30分钟；(聚乙二醇是相邻原生质体表面之间的分子桥)

13、然后用高钙和高酸碱度的溶液稀释聚乙二醇；(引起原生质体表面电荷的无序和再分布，从而促进融合)，用培养液洗去高Ca2和高酸碱度，用聚乙二醇诱导原生质体融合过程，电融合法，原理：改变原生质体膜表面的电荷，改变氧化还原电位，使异质原生质体结合并瞬时破裂质膜，然后开始连接质膜直至闭合并形成完整的膜形成融合。优点：原生质体损伤小，融合率高，重复性强；该装置精巧、方便、简单，可以在显微镜下观察或记录融合过程，从而省去了聚乙二醇诱导后的洗涤过程，诱导过程可控性强。在电融合的基本过程中，将制备好的亲本原生质体混合均匀并放入融合室。微电极型只有一个室，平行电极型有四个室，两个电极之间的距离为3毫米。整个装置放在

14、培养皿中。微电极型：当用5-12微安的脉冲电流进行1-5毫秒的间歇刺激时，原生质体将在几秒到几十秒内发生短暂收缩，并有两层膜。形成囊泡，通过点与表面连接，最后形成融合体。整个过程大约需要10-30分钟。平行多电极融合装置法：1兆赫交流电场产生双向电脉冲，如150伏/厘米，原生质体在电场力的作用下极化产生偶极子，原生质体紧密排列成珠。在适当时间和强度的DC脉冲(50ms，1.2-2KV/cm)作用下，质膜破裂，进一步形成融合，细胞电融合过程，原生质体融合过程包括三个主要阶段：1)两个或两个以上原生质体的质膜相互靠近；2)局部质膜紧密粘附并相互融合；3)融合完成，形成球形异核体或同核体。细胞融合的影响因素，聚乙二醇诱导法：聚乙二醇规格，纯度，作用时间电诱导法：原生质体密度交流电压交变电场振幅频率交变电场处理时间DC高频电压脉宽脉冲次数，5杂交细胞选择和鉴定，A，融合型B，杂交细胞选择法C，细胞杂交鉴定，A，融合型， 自体融合：一种发生在亲本原生质体同源融合中的细胞杂种：一种具有双亲染色体的完整集合且部分和谐的细胞杂种：在双亲染色体逐渐被排斥后，少量染色体重组，然后进入同步分裂，最后形成具有部分重组染色体的植物异质体细胞杂种：双亲的所有染色体都被排斥，但细胞质是双亲的嵌合细胞杂种； 不同种类的亲本原生质体经历了膜融合和细胞质融