特异性抗体制备技术

1、免疫原和抗血清制备技术,第一节 免疫原的制备 第二节 免疫血清的制备 第三节 抗体的纯化和鉴定,第一节 免疫原的制备,一、细胞性抗原的制备 二、可溶性抗原制备及鉴定 三、半抗原免疫原的制备 四、佐剂,绵羊红细胞的制备流程图,摇动 15-20min,4,可保存3周,取适量,NS洗涤3次 2000r/min 10min,NS稀释至 25%,细菌细胞抗原的制备流程图,液体培养或 斜面培养 3724h,100水浴 22.5h 杀菌,无菌试验,NS稀释成810亿/ml,O菌体抗原,返回,来源: 组织和细胞，其成分比较复杂。 1.组织和细胞成分混合抗原制备 2.蛋白质抗原制备 3.核酸抗原制备 4.类脂多

2、糖抗原制备 5.免疫球蛋白片段制备 6.纯化抗原的鉴定,可溶性抗原:蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、酶类、 补体、脂多糖、细菌外毒素和核酸,二、可溶性抗原制备及鉴定,返回,组织和细胞成分混合抗原制备程序,上清液 澄清,所用材料必须是新鲜或低温保存的,去除包膜或结缔组织,脏器进行灌洗,洗去血迹 及污物,NS内含0.5gL NaN2,冷浴中组织剪碎,装入捣碎机简内高速 粉碎制成组织匀浆液,3000rmin10min,取上清液,去除细胞碎片 及微小组织,离心,细胞破碎技术及评价,1.酶处理法 2.冻融法 3.超声破碎法 4.表面活性剂处理,常用酶类：溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等,1.酶处理法,方法：在一定的条

3、件下，能消化细菌和 组织细胞。,特点：此法适用多种微生物； 具有作用条件温和； 内含物成分不易受到破坏； 细胞壁损坏的程度可以控制。,2.冻融法,原理：因突然冷冻，细胞内冰晶的形成及 胞内外溶剂浓度的突然改变而破坏细胞。,方法：将待破碎的细胞置冰箱内冻结，然 后缓慢融化，如此反复两次，大部分组织 细胞及细胞内的颗粒可被融破。,特点：此法适用于组织细胞，对微生物细 胞作用较差。,3.超声破碎法,原理：利用超声波的机械振动而使细胞破碎。 由于超声波发生空化作用（cavitation）使得 液体形成局部减压引起液体内部发生流动，漩涡生成与消失时，产生很大的压力，使细胞破碎。超声波使用的频率从1kHz

4、20kHz不等，间歇进行，避免长期超声产热，导致抗原破坏。,特点：操作简单，重复性较好，节省时间； 多用于微生物和组织细胞的破碎。,原理：在适当的温度、pH及低离子强度的条 件下，表面活性剂能与脂蛋白形成微泡， 使膜的渗透性改变或使之溶解。,常用的有：十二烷基硫酸钠(SDS,阴离子型)、 二乙胺十六烷基溴（阳离子型）、聚山梨酯 （非离子型）、新洁尔灭等。,应用：破碎细菌，且作用比较温和； 提取核酸时，常用此法破碎细胞。,4.表面活性剂处理,蛋白质抗原制备,蛋白质是良好的抗原，要制备特异性高 的抗血清通常需要纯化。可采用： 1.超速离心法 2.选择性沉淀法 3.凝胶层析法 4.离子交换层析法 5

5、.亲合层析法,1超速离心法,原理:利用各颗粒在梯度液中沉降速度不同， 使具有不同沉降速度的颗粒,处于不同密度 的梯度层内，达到彼此分离的目的。,特点：用超速离心或梯度密度离心法纯化抗 原，极难将某一抗原成分分离出来。,应用：用于少部分大分子抗原和一些比较轻 的抗原物质的分离，如IgM、C1q、甲状腺球 蛋白、载脂蛋白A、B等。,原理：根据各蛋白质理化特性的差异，采用 各种沉淀剂或改变某些条件促使蛋白质抗原 成分沉淀，从而达到纯化的目的。,2、选择性沉淀法,常用方法：盐析沉淀法（不同盐浓度则溶解 度不同）；常用3350饱和度的硫酸胺。,特点：简单方便，纯度不高，粗提球蛋白。,应用：在大量制备中先

6、用此法粗提，再纯化。,原理：凝胶具有三维空间多孔网状结构的物质， 经适当溶液平衡后，装入层析柱。当含有各种 分子大小不一的混合物加在凝胶床面时，大分 子物质不能进入凝胶颗粒的网孔结构内，在凝 胶颗粒之间的空隙中很快地通过凝胶床，短时 间内被洗脱出来；而分子较小的物质则进入凝 胶网孔结构内，反复受到阻滞，洗脱较慢。分 成大、中、小三种类型。,3凝胶层析法（凝胶过滤法）,4离子交换层析法,原理：利用带离子基团的纤维素或凝胶，吸附交换带相反电荷的蛋白质抗原。各种蛋白质的等电点不同，所带电荷不同，与纤维素结合的能力有差别。当梯度洗脱时，逐步增加流动相的离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争纤维素上的电荷位

7、 置，从而使血清中的蛋白质分成球蛋白、球蛋白、球蛋白和清蛋白等几个部分而被洗脱下来，达到分离纯化的目的。,5亲和层析法（亲和色谱）,原理：依据抗原抗体的生物学活性进行分离和提纯的技术。将纯化的抗IgG附着于惰性的固相基质上，制成免疫吸附层析柱。当样品流过此柱时，待分离的IgG可选择性地与免疫吸附剂上的特异性配体(抗IgG)结合；当改变洗脱条件可重新解离，将待分离的Ig洗脱下来，达到纯化的目的。 优点：提取纯度高、抗原抗体不失活性。,正常细胞 ,标记细胞 洗滴,标记细胞 被酶裂解,加入特异 性抗体,其它蛋白 洗涤流失,SDS-PAGE 分离蛋白,亲和层析法示意图,核酸抗原制备,大分子的核酸具有免

8、疫原性。 提取核酸的主要步骤：,破碎细胞,核酸从细胞中游离出来,酸沉淀核,除去蛋白质,乙醇,酚和氯仿,苯酚法提取LPS：,干燥菌体或湿菌体,水中 混匀,激烈搅匀 加热5min,冰水 急冷,降至10以下,离心,上层的水层(含LPS) 下层的酚层 菌体残渣于底部,吸取 水层,透析 除酚,加热,超速离心,浓缩,LPS 在上层沉淀的透明胶状部内,绞出,悬于水中,离心,得纯化LPS,类脂多糖抗原制备,同温的苯酚,1酶裂解法 酶对免疫球蛋白的水解有极好 的专一性，不同的酶可将免疫球蛋白裂解 为不同的片段。,免疫球蛋白片段制备,2氧化法和还原法 是将免疫球蛋白轻、重 链分开的两种常用方法。,3. 还可用强变

9、性剂或利用改变pH将免疫球蛋 白亚单位分开。,酶水解免疫球蛋白示意图,Fc段，用以制备抗重链血清,F(ab)2，常作为抗体试剂用于试验,木瓜蛋白酶 （papain),胰蛋白酶 (pepsin),胃蛋白酶 (pepsin),1. 氧化法：优点是切开后，肽链不能重新 形成二硫键、便于肽链纯化； 缺点是色氨酸侧链容易被破坏。,氧化法和还原法评价,返回,2. 还原法：将二硫键还原成琉基。但极不 稳定，易重新形成二硫键，必须及时用 碘乙酸或碘化酰胺进行羧甲基化。,纯化抗原的鉴定,1.含量鉴定 2.理化性质鉴定 凝胶层析技术测定 聚丙烯酰胺凝胶电泳 凝胶管状电泳 超速离心 3.纯度鉴定 常用醋酸纤维膜电泳

10、 4.免疫活性鉴定 常用双向琼脂扩散试验,蓝色,1含量鉴定,在一定范围内，颜色深浅与蛋白质浓度呈直线相关。,方法：酚试剂法鉴定 主要试剂：磷钼酸-钨酸的混合酸 原理：,蛋白质中的酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸等能,钨酸、钼酸,还原,3H2OP20513WO35MoO310H20 和3H2P20514WO34MoO310H20,络合物的双缩脲法,蛋白质Ca2+,碱性,加深,蓝色,理化性质鉴定,已知分子量的标准品,测未知分子量：将样品在同一凝胶柱上，同一条 件下层析、洗脱、测保留体积，并查出分子量。 此法简便、样品用量少，有一定的实用价值。,凝胶柱,保留体积,分子量的对数,2.理化性质鉴定,绘制标准曲线

11、,凝胶层析技术进行测定,垂直电泳,聚合成大分子凝胶,聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）,有分子筛效应、电荷效应及浓缩效应，能精 确地分离和鉴定高分子物质。,PAG的分子筛效应测定蛋白质抗原的分子量。 原理：,双丙烯酰胺 N,N-methylene bisacrylamide,Bis,丙烯酰胺 (acrylamide,Acr),催化剂,3. 纯度鉴定,方法：醋酸纤维膜电泳进行鉴定。,返回,原理：蛋白质在一定pH下都带有电荷，由于 各种蛋白质等电点不同、分子量也异，因此 所带电量也各不相同，在外加直流电场的作 用下，它们泳动的速度不同，经一段时间后 即可彼此分开，形成电泳谱；从而判断蛋白 质抗原的纯度

12、。,特点：快速简便。,三、半抗原免疫原的制备,1.半抗原：低分子量的化学物质。例如多糖、 多肽、甾族激素、脂肪胺、类脂质、核苷、 某些药物(包括抗生素）及其他化学物品等。,2.载体：蛋白质类 多肽聚合物 大分子聚合物,3.半抗原-载体连接方法:,载体类型,1.蛋白质：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔 血清白蛋白、牛甲状腺球蛋白等。,2.多肽聚合物：人工合成的，常见的有多聚赖 氨酸，其分子量大（可达十几万到几十万)， 这种多聚物和半抗原结合后，可刺激免疫动 物产生高效价、高亲和力的抗体。,3.大聚合物：羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮 等，可与半抗原结合，加入弗氏完全佐剂亦 可诱发动物产生抗体。,半抗

13、原-载体连接方法1,碳化二亚胺法：,R-NH=CH-R,半抗原载体蛋白质,搅拌12h,室温24h,透吸除去未反应的半抗原,人工免疫原,混合,混合,半抗原-载体连接方法2,戊二醛法:,半抗原-NH2,载体蛋白-NH2,半抗原-N=CH-(CH2)3-CH=NH-载体蛋白,OHC-(CH2)3-CHO,*戊二醛是常用的带有两个活性基团的双 功能联接剂,半抗原-载体连接方法3,氯甲酸异丁脂法：,半抗原-COOH,载体蛋白-NH2,Cl-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-COO-COO-CH2CH(CH3)2,半抗原-CO-NH-载体蛋白,简便，用于类固醇抗原制备,HO-CH2CH(CH3)2,

14、半抗原-载体连接方法4,琥珀酸酐法：用于不含羧基衍生物半抗原制备,半抗原-CH2OH,CH2-CO CH2-CO,带羧基的半抗原琥珀酸衍生物,半抗原-CH2-OOC-CH2-CH2-COOH,返回,吡啶,再经氯甲酸异丁脂法或碳化 二亚胺法制备载体半抗原,四、佐剂,* 概念：与抗原同时或预先注射于机体，能增 加机体免疫应答或改变免疫应答类型的物质。,条件：增加抗原的表面积； 改变抗原的活性基团构型； 佐剂与抗原混合能延长抗原在局部 组织的存留时间； 可直接或间接激活免疫活性细胞； 无毒性或无副作用。,（二）常用佐剂的种类和制备,1.氢氧化铝佐剂：,5%硫酸铝,5%氢氧化钠,氢氧化铝沉淀,制成悬液

15、 即为佐剂,强烈搅拌,NS洗 二次,NS,等体积抗原,免疫接种,2.明矾佐剂,10%硫酸钾铝,氢氧化钠校正pH值至6.5,沉淀,乳状悬液,* 明矾佐剂抗原常用用于肌肉注射，皮下注射 易引起肉芽种和脓肿。,NS搅拌,NS洗 二次,离心,抗原,备用,防腐剂,作用大于不完全佐剂 局部形成肉芽种和溃疡 不能用于人体,弗氏完全佐剂,3.弗氏佐剂(Freund adjuvant),液体石蜡,完全乳化,备用,高压 灭菌,加热,抗原,弗氏不完全佐剂,卡介苗,羊毛脂,鉴定,一滴 乳剂,乳剂不散浮于液面,水中,混合,4.佐剂应用原则和评价,目的:增强抗原对机体的免疫原性； 增强抗体的产生能力； 为制备出高效价的免

16、疫血清； 增强可溶性抗原的免疫原性； 在某种情况下，改变Ag免疫应答类型； 延长抗原在免疫动物的时间； 改变抗原的分布； 增强局部对变应原的超敏反情况；,应用佐剂的缺点, 佐剂常混有微量其它物质，这些物质进 入体内后也可引起抗体的产主，影响抗 血清的特异性；, 注射佐剂可引起局部形成肉芽肿和无菌 性脓肿；, 反复注射，易发生超敏反应，使局部组 织坏死，甚至引起动物死亡。,第二节 免疫血清的制备,1.免疫动物选择 2.免疫方法 3.动物采血法 4.免疫血清的分离及保存,一、免疫动物选择,能作免疫接种用的动物主要是哺乳类和禽类。 兔、绵羊、豚鼠、鸡、山羊和马。,1.抗原与免疫动物种属差异越远越好；

17、,2.动物必须适龄、健壮、无感染的正常动物、 体重合乎要求；,3.不同动物种类对同一免疫原有不同的免疫 应答；,4.按需要量选择大小不同的动物。,二、免疫方法,3.免疫方案 全量免疫法：弗氏佐剂抗原多次注射 微量免疫法：卡介苗7天弗氏佐剂1月 抗原 混合免疫法：综合皮下、淋巴结和静脉,1.免疫原的注射剂量,2.免疫途径：免疫反应产生速度依次为静脉 腹腔肌肉皮下皮内淋巴结足掌,三、动物采血法,1.颈动脉放血法：最常用的方法 2.心脏采血法：要求操作熟练 3.静脉采血法：,1.4保存：可保存36个月 2.低温保存：-20-40，可保存23年 3.冰冻干燥保存：可保存35年,四、免疫血清的分离保存,

18、第三节 抗体的纯化和鉴定,1.抗体特异性的纯化 2.特异性IgG类抗体的纯化 3.特异性抗体的鉴定,一、抗体特异性的纯化,1.亲合层析法：将交叉抗原交联到Sepharose 4B上，装柱后，将预吸收的抗体通过亲合层 析柱，杂抗体吸附在柱上，流出液则是特异 性抗体。,2.吸附法：利用不含特异性抗原的抗原液，直 接加到免疫血清中，抗原则与抗体结合，上 清液则为无杂抗体的单价特异性抗体。,二、特异性IgG类抗体的纯化,1.盐吸沉淀法：经硫酸铵盐吸提取球蛋白 3次，基本为IgG类抗体，但不纯。,2.A蛋白亲和层析：SPA与IgG的Fc段有很强的 特异性的亲和力，细菌表面不同位点独立地 与抗体结合，一个

19、A蛋白至少可以结合二个 IgG分子。适合纯化细胞培养上清中的McAb。,3.其它：凝胶过滤、离子交换层析等,三、特异性抗体的鉴定,1.抗体效价的鉴定：即为抗体活性滴定,2.抗体特异性鉴定： 细菌类抗原的抗体用凝集试验 可溶性抗原的抗体用双向琼脂扩散试验,3.抗体的纯度鉴定：免疫电泳分析法,4.抗体亲和力鉴定：亲和力高则灵敏度好,第四节 单克隆抗体技术,单克隆抗体：由B细胞杂交瘤产生的只识别抗原 分子上一种抗原决定簇的抗体分子。,多克隆抗体：识别抗原分子上各种抗原决定簇 的多种抗体的混合制剂。,一、杂交瘤技术的原理及流程 二、单克隆抗体的应用,返回,单克隆抗体的制备,单克隆抗体是指由单个克隆的杂

20、交瘤细胞产生针对一种抗原决定簇的特异性抗体。它是采用B淋巴细胞杂交瘤技术（抗体的细胞工程）制备的。,一 .利用杂交瘤技术制备McAb的基本原理 （一）淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说，即一个B细胞克隆只产生一种抗体； （二）细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性； （三）利用代谢缺陷补救机理筛选出杂交瘤细胞，并进行克隆化，然后大量培养增殖，制备所需的McAb。,二. McAb的制备流程 亲本细胞准备细胞杂交融合（PEG）HAT选择性培养杂交瘤细胞克隆性培养与建株（有效稀释法）大量制备单克 隆抗体质量鉴定与分装冻存 （扩大培养或接种动物） （杂交瘤细胞冻存与复苏）,McAb的制备流

21、程,抗原免疫 免疫脾细胞 小鼠骨髓瘤细胞 (BALB/C小鼠) （经8-AG或6-TG诱导） (亲本细胞) 混合、融合（PEG） 选择性培养（HAT） 筛选和克隆化 冻存 阳性细胞建株（稳定分泌McAb） （杂交瘤细胞） 复苏 McAb大量制备（上清或腹水-鼠） 稳定性检查 纯化、鉴定（特异性、活性、含量）,三 亲本细胞准备 （一）免疫小鼠（BALB/C）脾细胞悬液的制备 1取BALB/C小鼠 812周龄，健康，雄性， 2只以上 2免疫原制备（抗原佐剂或不加佐剂） 免疫方案：常规法（多点皮下，多次） 脾内注射一次法 3取脾分离免疫脾细胞（免疫疗程结束后3 4d） 4镜检活细胞率达90以上，培养

22、液稀释成 108 （台盼兰染色，死细胞着染），备用,（二）小鼠骨髓瘤细胞悬液的制备（SP2/0，NS1） 1冻存细胞复苏后，置入含10新鲜小牛血清 的RPMI-1640培养液中，5CO2，37温箱 中培养，每23d换液一次，35d传代一次； 2取生长良好的瘤细胞（圆形明亮、排列整齐、 形态完整、密度适宜1106），台盼兰染色- 镜检活细胞率大于90以上，备用（对数生 长、中期）;,3实验用小鼠骨髓瘤细胞应每隔36个月，将 复苏细胞在含有8-AG或6-TK培养液中培养 一次，去除回复突变细胞。 四 细胞融合 A免疫脾细胞（108）B.骨髓瘤细胞（酶缺 陷,107）（10：1）,1融合操作 按比例

23、（10：1）将免疫后脾淋巴细胞（A）与经处理的缺陷型骨髓瘤细胞（B）混合，加入2050ml RPMI-1640液，1000rpm 10min，弃上清，37水浴中，吸取1ml 37预温的50 PEG缓慢滴入，1min内加完，37静置1min，再滴加入完全培养液（1min中加完），尔后加1640液至50ml，终止PEG作用。800rpm10min弃上清，沉淀细胞悬浮后转入选择性培养。,2细胞融合剂一聚乙二醇的特牲 聚乙二醇（polyethylene glycol,PEG）是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚体。 PEG可与水分子借氢键结合，在高浓度（50）的PEG溶液中自由水消失，导致

24、细胞脱水而发生质膜结构的变化，由此引起细胞膜融合。所以在细胞融合试验中多采用较高浓渡（4050），MW为6000。但在PEG的高浓渡下，,细胞可因脱水显著而遭受破坏，故实际工作中有时在PEG溶液中加入适量的凝集素（如Con-A等），此时PEG的浓度可降 低至2030，而细胞融合效率反而提高23倍，这是因为凝集素与膜结构糖链特异结合，空间构型发生改变有利于细胞融合。凝集素添加浓度常为PEG的1/103104。,优点： 易制备，好控制； 活牲稳定； 使用方便。 缺点： 对细胞有毒牲，尤其是高浓度； 细胞融合率低，约为1105; 不能在显微镜下直接观察其细胞 融合过程。,3饲养细胞的制备 在体外细胞

25、培养中，单个或少数细胞不易生长与增殖，需加入其他活细胞共同培养，才可能使之生存。加入的细胞称为饲养细胞（支持与辅助体外细胞生长增殖的细胞）。 常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞、胸腺细胞、传 代胚胎纤维母细胞等。,小鼠腹腔巨噬细胞的制备： 取810周龄同系小鼠，断颈处死，无菌操作腹腔内注射1015ml完全培养液，用消毒拇指轻揉腹部数次后，吸回腹腔液体，计细胞数。用培养液调整细胞浓度为1105/ml，备用。一般一只小鼠腹腔液可获取细胞31065106，可供一次融合用（亦可取两只小鼠腹腔巨噬细胞混合使用）。,融合前一天，在96孔板中先用饲养细胞培养，0.1ml/孔（含104细胞），融合时弃

26、培养液，再分别加入混合细胞悬液。 五 杂交瘤细胞的选择性培养（HAT） （一）原理 （次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶核苷） 亲本细胞杂交融合后，除了所需的杂交瘤细胞外，还存在自身融合的4倍体细胞和未融合的二倍体亲本细胞，后者必需予以清除，为此目的，一般选用HAT培养基进行筛选性培养，其原理是：,在HAT培养液中，细胞合成核酸的主要途径被氨基喋呤（A）阻断，而用于细胞融合的骨髓瘤细胞均系预先经过8-氮鸟嘌呤等处理，而缺少HGPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶 ）或TK（胸腺嘧啶激酶），其合成核酸的补救途径也被阻断；脾细胞虽含有HGPRT或TK，但它们在体外难以长时间存活（一般只能存活57天）。

27、,只有骨髓瘤细胞和脾细胞融合后所形成的杂交瘤细胞，由于可从脾细胞中获得所缺乏的酶类，又具有在体外培养条件下不断生长的能力，故能在含HAT培养液中通过补救途径合成核酸而继续生长繁殖。,DNA合成途径 经典 补救 次黄嘌呤（H） HGPRT 氨基酸 氨基喋呤（A）切断 核糖核苷酸 DNA 糖 核糖核苷 TK 胸腺嘧啶（T）,（二）方法：融合后35d换一次HAT培养液，每次吸出培养孔旧液1/2，加入新液，连续2周。35天后未融合及自身融合的细胞逐渐死亡。1周左右可出现克隆，并不断增殖，当集落大于3mm或布满孔底1/2时，即可取上清作抗体活性检测，并补加新鲜HAT培养液，培养3周后改用普通完全培养液，

28、进一步克隆化培养。 理想的融合试验，约7080孔有细胞克隆生长。,六 杂交瘤细胞克隆性培养与建株 （有限稀释法） 目的：筛选获得单个分泌抗体的杂交瘤 细胞 原理：f (0) =e-1 (poisson公式) 1 f（O）=0.37,即约有37的培养孔无细胞生长，63孔有细胞生长，其中半数含单个细胞，另一半孔可能超过1个细胞，如果再次倍比稀释，不断降低细胞密度，就可增加获得单个细胞的机率。 例：10个细胞/10ml0.1ml/孔，分别接种100个培养孔。理论上计数，平均每孔1个细胞。,方法：先从选择性培养后的孔内吸出细胞悬液作细胞计数，测出1ml的细胞数，用HT培养液稀释至细胞浓度达5060个/ml。尔后分别加到96孔板，每孔加0.1ml（约56个细胞/孔），一般接种两排，剩余的细胞悬液作倍比稀释，再接种两排，,如此类推，直至每孔含细胞0.51个，培养710d后，选择单克隆阳性抗体细胞孔再一次克隆，如此重复35次，直至100阳性孔时为止，以确保抗体是由单个克隆细胞所产生。 本法简便、效果好，已广泛被采用。（其它克隆化方法，尚有：软琼脂法，显微挑选法。FACS-流式细胞光度分析法等）,体外细胞培养的一些基本知识 原代细胞（异性细胞）培养原代培养 传代细胞（同性细胞）培养传代培养 永久性传代细胞细胞株（建株细胞） 特点：代间细胞特性稳定，较少退化， 14周 体外细胞的生