二三代测序技术的介绍和比较

1、二代和三代测序技术的介绍与比较,测序技术发展 二代测序 三代测序 应用,目录,测序技术发展,测序成本,二代测序技术,Illumina,ABI SOLID,Roche 454,二代测序技术 Illumina,Illumina公司的Solexa和Hiseq应该说是目前全球使用量最大的第二代测序机器，这两个系列的机器采用的都是边合成边测序的方法，它的测序过程主要分为4步,DNA待测文库构建 Flowcell 桥式PCR扩增与变性 测序,Illumina测序仪比较,Illumina测序仪的选择,二代测序Roche 454,Roche 454测序系统是第一个商业化运营二代测序技术的平台。,二代测序 So

2、lid,文库制备,油包水PCR,Beads固定,连接测序,引物reset,ECC,SOLiD使用连接法测序，基于“双碱基编码原理”获得SOLiD颜色编码序列，随后的数据分析比较原始颜色序列与转换成颜色编码的reference序列，把SOLiD颜色序列定位到reference上，同时校正测序错误，并可结合原始颜色序列的质量信息发现潜在SNP位点。,二代测序 Solid,二代测序分析流程,Germline,二代测序分析流程,Somatic,二代测序临床应用,生育健康 癌症 遗传病 用药指导 传染病 移植分型 个体健康,在肿瘤临床中的应用优势,临床应用,二代测序肿瘤研究,肿瘤发生发展机理 肿瘤分子标

3、记物 肿瘤分子分型 肿瘤病理关联,研究方向,遗传性肿瘤家系 队列研究,研究方法,TCGA Cosmic ONCOMINE UCSC Xena cBioPortal . .,数据库及数据挖掘,队列分析案例,Nature communications, 2016, Breast cancer,三代测序,单分子测序 PacBio /SMRT Oxford / Nanopore Thermo / Ion Torrent,三代测序SMRT,PacBio SMRT技术应用了边合成边测序的思想，以SMRT芯片为测序载体。 4色荧光标记 4 种碱基，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。 通过检测相邻两个碱

4、基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，可以通过这个来之间检测甲基化等信息。 SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP。 DNA 聚合酶是实现超长读长的关键之一。 测序错误率比较高，通过多次测序纠错。,三代测序Nanopore,基本原理 当DNA碱基通过纳米孔时，使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳米孔的电流强度（每种碱基所影响的电流变化幅度是不同的），灵敏的电子设备检测到这些变化从而鉴定所通过的碱基。,Oxford Nanopore Technologies公司所开发的纳米单分子测序技术，是基于电信号的测序技术。,Nanopore 主要特点,读长长，大约在几十kb，甚至100 kb

5、 错误率目前介于1%至4%，且是随机错误，而不是聚集在reads的两端; 数据可实时读取； 通量很高(30 x人类基因组有望在一天内完成)； 样品制备简单又便宜，不破坏DNA; 直接读取甲基化修饰位点，准确率可达99.8%,三代测序Ion Torrent,基本原理 当DNA聚合酶把核苷酸聚合到延伸中的DNA链上时，会释放出一个氢离子，反应池中的PH发生改变，位于池下的离子感受器感受到H+离子信号，H+离子信号再直接转化为数字信号，从而读出DNA序列。,Ion Torrent是一种基于半导体芯片的新一代革命性测序技术。,特 点 不需要昂贵的物理成像等设备，成本相对较低，体积小，操作简单； 快速，

6、除了2天文库制作时间，整个上机测序可在2-3.5小时内完成； 不过整个芯片的通量并不高，目前是10G左右，适合小基因组和外显子验证的测序。,Ion Torrentshort reads,Ion Torrentlong reads,Ion Torrent 主要应用,靶向测序 转录组测序 异倍性和 CNV 分析 小分子 RNA 和 miRNA 测序 病毒分型 外显子组测序 微生物测序 通过测序进行基因分型 De Novo 从头测序 细菌分型,三代测序技术应用,全基因组测序 从整体上以单碱基对分辨率检测结构变异。 更高质的人类基因组全新组装； 生成高品质的植物、动物基因组； 同时检测表观遗传信息； 在单次实验中进行完整的微生物基因组测序；,靶向捕获测序 表征人类遗传疾病的复杂区域； 解决微生物和传染病研究中的复杂区域； 获得全长HLA等位基因变异而无插补； 表征复杂免疫区域的扩增单体型； 直接检测转录本的全长，消除了使用算法对转录本进行重建的步骤,三代测序在肿瘤研究中的应用,SMRT测序能够提供有关癌症基因组复杂性最全面的观点 通过对Iso-form多样性的完整检测（包括基因融合、剪接位点和内含子等）发现癌症样本中隐藏的生物学机制； 以极高的分辨率检测SV，包括CNV的基因组背景、插入/缺失/倒位/易位的准确断点以及不稳定的微卫星标志物的完整序列； 靶