化学发光法的原理技术要点及评价应用

1、化学发光免疫技术第一节发光和化学发光剂第二节发光酶免疫测定(cleia ) (chemiluminescenceenzymeimmunoassay )第三节化学发光免疫测定技术(clia ) (chemiluminescenceimmunoassay )第四章电化学发光免疫测定技术(电致发光免疫)，化学发光免疫技术：将敏锐的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定一体化的检测技术。 概念、特征：特异性高，敏感性高，分离简单，快速，试剂无毒，安全稳定，自动化。 化学发光免疫技术的类型为发光剂1 .发光酶免疫测定(cleia ) chemiluminescenceenzymeimmunoassay2.

2、化学发光免疫测定技术(clia ) chemiluminescenceimmunoassay3.电化学发光免疫测定技术(EC 分为electrochemiluminescenceimmunoassay分离方法的不同1 .微粒化学发光免疫测定2 .磁性粒子化学发光免疫测定，第一节发光和化学发光剂，发光的物质从电子激发状态回到基态时，放出的能量作为光的放出出现。 1 .光照射发光：发光剂照射短波长的入射光进入激发状态，回到基态时发出长波长的可见光。 2、生物发光：的反应底物在荧光素酶的催化下利用ATP生产能力生成激发态的氧化荧光素，后者在返回基态时多馀的能量作为光子释放。 3 .化学发光：常温下通

3、过化学反应发光。 化学发光是一个多阶段的过程。 荧光素酶ATP； O2； Mg2，氧化萤火虫荧光素，生物发光，返回，光AMP O2 CO2，化学发光，机理：某些化合物利用化学反应产生的能量可以使其产物分子和反应中间状态分子上升到电子激发状态。 该产物分子或中间状态分子衰退到基态时，以放出光子的形式放出能量(发光)。 二、化学发光剂、化学发光剂或发光基质：化学发光反应中涉及能量转移，最终以释放光子的形式释放能量的化合物。 发光剂可分为荧光素、生物发光剂、化学发光剂，与能参与化学发光反应的抗原或抗体结合形成稳定的结合物试剂耦合后也能保持高的量子效果和反应动力被标记物的理化特性，特别是不改变免疫活性

4、或极端变化。 化学发光剂应满足以下条件，1 .酶促进反应的发光基质是指通过酶的分解作用发光的一种发光基质。 CLEIA中常用的酶是HRP和AP HRP的发光基质是鲁米诺，对羟基苯乙酸AP的发光基质是AMPPD，4-MUP (荧光基质)的特征：标记物和过氧化物酶的基质都是可能的，1.1鲁米诺，H2O2/oh -，HRP N2 H2O光、对羟基苯乙酸(HPA) HPA在H2O2的存在下被HRP氧化成氧化二聚体(荧光物质)，用350nm的激发光发出450nm波长的荧光，可用荧光光度计测定。 1.2 HPA、H2O2 HRP :荧光，氧化二聚体，AMPPD，AMPPD在碱性条件下，通过AP酶分解生成相

5、当稳定的AMP-D阴离子，其分解半衰期为230min，发出波长470nm的持续光，其强度为15 、光，ap/oh-hpo4-，1.3 AMPPD，4-MUP，4-MUP被AP催化生成4-甲基丝氨酸，通过360nm的激发光产生448nm的荧光，可以用荧光光度计测定。，荧光，AP，1.4 4-MUP，4-MU，360nm激发光，h3po 4，2 .直接化学发光剂，不使用催化剂，只要改变溶液的pH就能发光的物质。 反应快，背景低，信噪比高，发光量和AE浓度呈线性关系。 常用试剂：吖啶、AE、CO2光、3 .电化学发光剂是指通过在电极表面进行电化学反应而发光的物质。特征：反应用电极进行电子供体为三丙胺

6、(TPA) 化学发光剂：哌啶钌、反馈、哌啶钌的分子结构图、第二节发光酶免疫测定(CLEIA )，原理是一种酶免疫测定。 但是，用于最后的酶反应的基质是发光剂，通过发光反应发出的光用特定的机器来测定。 二、技术类型为酶反应促进基质，1 .荧光酶免疫测定技术2 .化学发光酶免疫测定技术，免疫学反应模型，1 .二抗体夹心法和二抗原夹心法3 .固相抗原竞争法：荧光酶免疫测定技术的反应原理图，清洗上清，化学发光酶免疫测定技术的反应原理图，清洗废弃上清， 电化学发光的原理图，该过程使电极表面产生大量光子，增强光信号，返回，激发状态不稳定，基态，电极，1 .抗原抗体结合反应将被抗体包复的胶乳微粒和待测标本放

7、入反应杯，加热一定时间后，加入AP标记抗体，加热， 可以形成固相包复抗体-抗原-酶标记抗体复合体，技术要点2 .将分离技术复合体转移到玻璃纤维上，用缓冲液清洗后，未结合的抗原溶出，酶标记抗体、抗原胶乳微粒抗体复合体残留在纤维膜上。 3 .在酶发光促进反应中加入4-MUP，酶标记抗体上的AP分解4-MUP，形成4-MU，用360nm的激发光照射发出448nm的荧光，用荧光计记录、放大，根据标准曲线从计算机中计算测定物质的含量通过标本中相应抗原或抗体和酶标记抗体或抗原和一定模式的免疫学反应后，最终用磁场分离结合酶标记物IC和游离酶标记物的技术。 分离技术，2 .微粒捕获法：使用的粒子以非磁性微粒为

8、抗体或抗原的被复载体，用纤维膜柱进行酶标记物的结合状态和游离状态的分离。 3 .包复珠体分离法：用聚苯乙烯等材料制作珠体，在珠体上包复抗原或抗体，抗原抗体反应后，分离结合状态和游离状态的酶标记物，第三节化学发光免疫测定技术(CLIA )，第一、原理化学发光剂直接标记抗原或抗体，测定对象标本中的Ab或Ag， 用磁场分离与磁性粒子性的Ag或Ab反应的结合状态(沉淀部分)和游离状态的化学发光剂标记，加入发光促进剂进行发光反应，定量或定性地进行发光强度的测定。 二、技术类型1 .分离方法常用的磁粒子分离技术2 .免疫学反应模式和酶发光免疫测定技术3 . 技术要点，2 .分离技术在电磁场清洗23次后，立

9、即洗掉未结合的多馀的Ag和标记Ab。 3 .在化学发光反应中清洗的珠子中加入H2O2和pH修正液NaOH后，AE不需要催化剂就分解发光，用聚光器接收，用光电倍增管放大，记录在1S内产生的光子能量，其积分与被测定物的含量成比例，根据标准曲线，测定器被复盖。 1.AE背景噪音低，化学反应简单，快速，无催化剂。 方法评价表明，2.AE与大分子的结合不减少产生的光量，增加灵敏度，灵敏度达到10-15g/ml。 3.AE标记试剂的有效期长，达1年。 4 .固相分离剂是极幼小的磁粉，除了增大被复面积、加快反应之外，还能使洗涤和分离更简单、迅速。第四节电电化学发光免疫测定技术(ECLI )，原理是电极表面电

10、化学诱发的特异性化学发光反应，实际上包括电化学和化学发光两个过程。 ECL会引起电发光反应，而CL会通过化合物的混合引起发光反应。 用化学发光剂镥Ru(bpy)32标记Ab，通过Ag-Ab反应和珠粒分离技术，对由镥在电极上发出的光的强度测定的Ag或Ab进行了定量/定性。 二、技术类型1 .分离方法常用的磁性粒子分离技术2 .免疫学反应模式和酶发光免疫测定技术3 .对应标记物不是酶，1 .将金红石吡啶标记抗体和生物素标记抗体同时放入一个反应杯中进行孵化反应，技术要点，2 .链霉菌把磁珠包住再次孵化，使生物素(b )与亲和素(a )结合，使磁珠和Ab一体化，形成双Ab三明治法。 3、蠕动泵将形成的Ru(bpy)32 -Ab-Ag-Ab-B-SA-珠复合体吸入流动测量室，珠通过工作电极下的磁铁吸附在电极表面。 同时，游离的Ab也从测定室中被吸引。 4 .向蠕动泵施加TPA，向电极施加电压，启动ECL反应过程。 该过程围绕电极表面反复进行，产生多个光子，光电倍增管检测光强度，与Ru(bpy)32的浓度呈线性关系，因此可以测定Ag的含量。 回到电路图，抗体包复样品Ru(byp)2 TPA缓冲磁珠抗原标记抗体液清洗，3、方法评价，标记物的回收，发光时间长、强度高、容易