生物分离工程（三版）（孙彦）

1、了解生物分离工程、亲和纯化技术、整体学习目的和要求、生物亲和作用的本质、影响因素和作用体系。 亲和纯化的原理和操作。 了解几种常用的亲和纯化方法。 目录，生物亲和作用亲和色谱原理应用亲和色谱法的亲和色谱法的亲和色谱法其他亲和色谱法的亲和色谱技术，生物亲和作用-学习知识记录：理解生物亲和作用的概念：影响生物亲和作用的本质、亲和作用的因素应用：理解常用亲和作用体系、亲和作用的由来的Affinity一词来源于拉丁语的affinitus，意味着结婚、亲缘关系、生物亲和作用、定义，生物分子结构和性质非常接近生物分子间的这种特异相互作用被称为亲和作用、生物亲和作用本质、亲和作用机制，特别是蛋白质表面存在某

2、种凹陷或凸结构的结构，并不知道正好可以使其中的小分子进入，形成构象的键链关系亲和作用不仅具有结构上的相似性， 很多力的相互作用、亲和作用中的静电作用、中性pH下蛋白质分子上的天冬氨酸、谷氨酸、半胱氨酸等酸性氨基酸残基负电荷，精氨酸、赖氨酸、组氨酸等碱性氨基酸带正电荷的n末端氨基酸-氨基带正电荷， c末端氨基酸羧基带负电荷的近距离强静电引力、亲和作用中的氢键作用、亲和作用的分子对的一分子中含有氧原子或氮原子的结合部位间形成O-H-O或O-H-N的氢键作用的氧和氧或氮和氧原子与氢原子大致排列在一条直线上， 且原子间距离是否在一定程度上达到氢键的发生受到结合部位间的位置关系的严格限制，亲和作用中的疏

3、水性相互作用只要亲和作用的分子对的一方分子中含有芳香环或羟基链等疏水基， 另外一个结合部位也包含疏水区域，在两者间发生疏水性相互作用的苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、亮氨酸、亮氨酸、蛋氨酸和脯氨酸、生物亲和作用-亲和作用中的相互作用、静电作用氢键-疏水性相互作用配位键弱共价键、亲和作用、静电作用、氢键， 除疏水相互作用、配位键弱共价键、“键”和“键孔”的关系之外，生物亲和作用还需要特殊的相互作用，这也是亲和作用特异性较高的主要原因，是影响生物亲和作用-亲和作用的因素，离子强度pH抑制氢键形成的物质温度是液体离子螯合剂， 离子强度对亲和作用的影响，亲和作用主要来自静电引力，如果提高离子强度，亲和作用就

4、会减弱或完全破坏，即使提高离子强度，氢键作用也会降低或消除； 亲和结合作用主要来源于疏水性相互作用，增大离子强度时能提高亲和结合作用的pH值对亲和作用的影响是，作为两性电解质的蛋白质含有多个解离基，不同解离基具有不同解离常数的静电引力对亲和结合作用有很大贡献时，pH值对亲和作用有很大影响， 也就是说，在适当的pH值时亲和键作用高，在其他pH值时变弱到亲和键作用消失的其他因素对亲和作用的影响是：抑制氢键形成的物质在亲和键作用中存在氢键的话，加入尿素和盐酸胍就会减弱亲和作用。 温度上升加剧了分子与原子间的热运动，减弱静电作用、氢键与配位键、增强疏水性相互作用的离子性螯合剂，亲和作用来自亲和分子与金

5、属离子的配位键，加入乙二胺四乙酸等螯合剂来除去金属离子，就失去了亲和作用，是常见的亲和作用体系， 亲和纯化的定义是将具有亲和作用的两种分子中一种分子与固体粒子或可溶性物质共价键合，特异性吸附或结合另一种分子，从混合物中选择性分离纯化另一种分子的方法称为亲和纯化。亲和纯化中，一般将亲和作用分子对中固定的分子称为亲和结合对象的配体。 在亲和分配平衡、亲和作用体系中，配体为l，蛋白质为e时，配体与蛋白质的结合反应表示为结合常数，结合常数越大(或解离常数越小)，表示亲和结合作用越强。 一般仿射系的耦合常数为104108L/mol，最高达到1015 L/mol，此时的仿射键几乎不可逆。 亲和色谱原理-学

6、习要点，亲和色谱的原理和操作，亲和色谱的定义，亲和色谱利用亲和色谱吸附作用分离纯化生物物质的液相色谱.术语“亲和色谱”包括用于仿射色谱的固定相是结合仿射色谱的仿射色谱的原理，仿射色谱操作与一般的固定床吸附操作方式类似，大多采用阻断式前端分析法，进料、杂质洗涤含有亲和色谱原理、原料液供给(feedstock loading )目标物的原料液通过柱，直到目标物在柱出口透过杂质，以与溶解原料的溶液相同组成的缓冲液作为清洗液， 清洗柱除去不吸附杂质的生成物溶出(target product elution )目的生成物和解离配体的溶液溶出目的生成物利用柱再生(column regeneration )

7、的清洗液清洗再生柱、仿射色谱介质-学习报告理解：间隔物的作用，常用仿射色变的应用：仿射色变的固定方法，应用实例和仿射色变的要求，仿射色变，抗体和蛋白，酶的抑制蛋白中存在抑制其活性的物质，称为酶分布广泛，有胰蛋白酶抑制剂(结合常数109 L/mol )和氨基苄基胺(结合常数4104 L/mol )等小分子化合物等天然生物高分子。 抗体抗体和抗原之间有很高的特异性结合能力，结合常数为107 1012 L/mol蛋白a (或也称为a蛋白) a蛋白是分子量为42 kDa的蛋白，存在于金黄色葡萄球菌的细胞壁中。 与动物免疫球蛋白G(IgG )有很强的结合作用。 亲和配基-凝集素和色素、凝集素是与糖特异性

8、结合的蛋白质的总称。 这个蛋白质有糖的结合部位。 可以作为含有多糖类、糖蛋白等糖的生物分子的配体。 辅酶和磷脂的各种脱氢酶和激酶，必须在辅酶的存在下表达其生物催化活性。 辅酶和脱氢酶之间有亲和性。 三嗪系色素之类的色素与NAD的结合部位相同，具有抑制酶活性的作用，具有与脱氢酶、血清白蛋白、干扰素、核酸酶、溶菌酶等的结合作用，亲和配位-过渡金属等过渡金属离子与蛋白质表面的组氨酸的Cu2等过渡金属离子与n、o、s等供电原子产生配位键。 肝素是动物肝脏等器官中存在的酸性多糖类物质，分子量从5到30kDa，与凝血蛋白质、脂蛋白等有亲和性。 亲和色谱-亲和色谱， 亲和色谱-亲和色谱介质满足条件，具有亲水

9、性多孔结构，不特异性吸附，物理和化学稳定性高，包含能激活高机械强度的反应基粒径均匀的球形粒子亲和色谱的固定化方法介质的活性化、介质的活性化方法-溴化法、溴化活性化法是亲和色谱介质连接含有氨基的配体的最初的溴化活性化法，向ph11中加入NaOH，将配体连接到软性介质上但是，溴化氰是一种毒性强的试剂，具有挥发性。 溴化氰活化介质后形成的氰基容易水解，影响偶联效率，活化的介质带强电荷，导致非特异性吸附增加等。介质活化方法环氧法、表氯醇活化具有方便、快速、活化率高、毒性低的特点，是目前广泛采用的制造方法。 活化方法：用水洗涤介质后，加入表氯醇和适当浓度的NaOH，使振动反应达到2.5h左右。 为了得到

10、更高的活化效率，其中表氯醇和NaOH的用量、NaOH浓度、反应时间可以通过具体的实验进行调整。 由于表氯醇是油相，NaOH溶液是水相，为了促进两者的反应，通常在混合物中加入药芯二甲基亚砜(DMSO )。 作为介质的活化方法的羰基二亚胺法、仿射色谱间隔臂的作用，在配体分子量小的情况下，为了排除立体障碍作用，在配体和载体之间连接一个“间隔臂”间隔臂的长度需要有一定的限制，一定的长度配体与目标分子的亲和力减弱，仿射色谱影响仿射色谱的因素，杂质在材料液中目标产物浓度低、杂质多的少量杂质的非特异性吸附，是纯化效果杂质的非特异性吸附与载体材料、配体固定化方法等多种因素有关的原料液的流速增大、分离速度加快，

11、但柱效应降低，仿射色谱-靶产物的特异性溶出、特异性溶出以仿射色谱或与靶产物具有亲和性结合作用的小分子化合物为溶出剂特异性溶出条件温和，有助于保护目标物的生物活性。 另外，因为只是特异性地溶出目标物，所以对于特异性低的亲和系和非特异性吸附剧烈的物质，特异性地溶出有助于提高目标物的纯度。 亲和色谱-目标物的非特异性洗脱、非特异性洗脱是提高洗脱液的pH值、离子强度、离子种类和温度等理化性质，降低目标物亲和色谱的作用，是经常被采用的洗脱方法。 亲和结合力大，无法用通常方法洗脱吸附的目标物时，用尿素或盐酸胍等改性溶液使目标物发生结构变化，失去与配体的亲和结合作用。 但是，这些改性剂容易使目标物和固定化配

12、体失活或不可逆地改性，所以需要慎重使用。 仿射薄膜-学习点，仿射薄膜的原理和特征应用：了解仿射薄膜的实际应用，仿射薄膜-定义，仿射薄膜用仿射修饰的微滤镜亲和膜-亲和膜的提案，固定床亲和色谱的缺陷以多糖凝胶为固定相，机械强度低，流速限制扩大困难(扩大采用放射状扩大)亲和膜构想提出“降低柱高，增大柱径，降低电压，提高流速”， 仿射膜-仿射膜的原理是仿射配体被固定在仿射膜孔表面上， 流体在对流状态下透过膜孔的过程中，目标蛋白与配体接触并吸附的仿射流过滤器-学习要点：仿射流过滤器的原理和特征应用：了解仿射流过滤器的实际应用，仿射流过滤器-定义， 仿射流过滤器结合了生物亲和相互作用和膜分离的蛋白质类生物

13、高分子的分离纯化技术、仿射流过滤器原理、传统的膜过滤分离蛋白质可以分离基于分子量差异的分子量差异10倍以上的物质， 将选择性差的仿射配体固定在特定的水溶性聚合物或不溶性微粒上时，目标蛋白质选择性地吸附在修饰这些仿射配体的材料上，目标蛋白质和杂蛋白质之间产生大的尺寸差，膜分离选择性的目标产物被捕获、溶出，得到纯品提高亲和过滤的特征，吸收膜分离的优点，增强亲和吸附高的选择性，连续操作容易吸收的特征亲和载体具有没有内部扩散阻力，目标分子亲和结合速度快的缺点，一个理论板，效果差，其他亲和过程-学习要点， 理解：上述亲和纯化方法的原理和操作应用：理解上述方法的适用范围，其他亲和过程-亲和双水相萃取亲和双水相萃取以耦合亲和配体的聚乙二醇为聚合物作为目标产物的双水相萃取，通过亲和配体的亲和作用，促进目标蛋白质向PEG相的分配，提高分配系数和选择性，提高其他所谓亲和色谱法，是在亲和色谱相中加入通常的表面活性剂，再添加另一个以亲水性头部为目标分子的亲和色谱法，通过与亲和色谱的亲和作用，促进目标物向对凝胶相的分配。 作为其他亲和过程的亲和沉淀的定义是亲和沉淀是生物亲和作用和沉淀分离