流动相脱气#内容清晰

1、经过40余年的发展，商品化HPLC仪器的性能大为改善：泵的精度提高、脉冲降低；进样器的重现性极佳；各种检测器的灵敏度也大大提高。因此，一些非仪器的因素，例如：样品组分的吸附和稳定性；流动相种类选择及制备时的重现性，反而成为制约高灵敏度、高重现性的连续自动HPLC分析的罪魁。此外，流动相中溶解的气体也影响检测器的灵敏度和基线的稳定性。控制流动相中溶解空气的量，即所谓“流动相脱气”是本专辑阐述的问题。文中讨论了流动相脱气的原理和目前采用的几种方法。希望本文提供的信息能有助于读者选择采用量最适宜的脱气方法。1、流动相中溶解空气引起的问题 首先，为了进一步证实脱气的重要性，我们将列举流动相中溶解空气所

2、引起的问题(见图1)。如果采取适当的脱气措施，这些问题都不难解决。上述问题可粗略地分成：形成气泡产生的问题以及未形成气泡，由溶解空气引起的问题。此外，据报道，溶液中溶解的氧气可能氧化样品组分和(或)流动相及固定相组分，从而产生不良影响。请读者参考有关报道，本文将不予讨论。2、形成气泡的机理 气泡形成的原因有多种，但归根结底是由于气体在液体中达到超饱和状态。如果一种液体任其与空气接触而无外界干预，那么气体进进出出，迟早要达到饱和（平衡）状态。平衡状态时溶解空气的量与溶液的性质、气体的种类有关，同样也与外界条件，诸如压力、温度等有关，例如：在25、1大气压下（氧的分压0.2大气压左右）1ml水中溶

3、解0.006ml的氧即达到饱和状态。如果，溶液中溶解气体量超过饱和状态时的量(超饱和状态)，则只要轻加振动或搅拌即会产生气泡。21）温度升高一般而言，溶剂中能溶解气体的量随温度升高而降低，当一瓶溶剂从温度较低的贮存室移至温度较高的实验室时，则过量溶解的气体以气泡的形式逸出。从冰箱中取出的可口可乐，在较高温度的环境中打开的话，大量二氧化碳气体以气泡形式冒出，便鉴于上述原理。图3是空气中各种气体在分压1个大气下1ml水中饱和气体量随温度变化的曲线。图中指的是一个大气压的分压，如果换算成一个大气压下的溶解曲线，根据氧在空气中含量20，氮在空气中含量78%，还要分别乘以0.2和0.78。22）压力降低

4、气体的分压增高，气体在溶剂中溶解量增大，反言之，在较高压力下达到饱和的溶液一旦压力降低便会产生气泡。23）溶剂混合气体的溶解量既与气体的种类有关，也与溶剂的种类有关。一般而言，极性低的气体较易溶解于低极性的溶剂，反之亦然。图5是气体在不同溶剂中的溶解量。由图5可见气体在苯和甲醇中的溶解量大体相同，但如果换算成摩尔数，即相同分子个数溶剂中气体的溶解量，则很显然，空气在低极性溶剂中的溶解度更大些。 然而，当两种不同的溶剂混合时，混合溶剂中溶解的空气量将作何变化呢？事实上，混合溶剂中能容纳的空气量往往要比各别溶剂所能容纳空气的总量要小。图6是25，分压为1大气压的情况下氧在水、乙醇混合溶剂中的溶解曲

5、线（图中实线）。同样条件下，氧在水中的溶解量位于A；在乙醇中的溶解量为于B点。如果等量的乙醇与水混合，氧的溶解量似乎应在AB联接线（虚线）的C点上，而实际的溶解量要比C小，位于D。因此，当乙醇和水等量混合时，相应于C和D之间差值的量的氧气将以气泡的形式逸出。同样的情况亦将发生在水和甲醇以及水和乙腈混合的场合。甚至两种水溶液混合都可能产生气泡。其原因是盐的浓度变化。如图7所示，随着盐的浓度增加，能氧气量与盐的浓度之间并非线性关系，而是呈向下弯曲的曲线关系（如图中硫酸钾溶液）。3、流路中产生气泡引起的问题下面将讨论在HPLC实践中，由于上述机理而在流路中形成气泡的不良影响。31）流动相容器产生气泡

6、的影响流动相容器中产生气泡主要是由于空气在流动相中超饱和。其原因如下。(1) 温度升高贮存室与实验室之间的温差或早晨与中午之间的温差都可能使流动相温度升高。(2) 吸热反应搅拌不足某些溶剂混合时吸收热量，使温度降低，此时如不充分搅拌，随着混合溶剂温度上升至室温，同样会造成气体的过饱和而产生气泡。当这些气泡通过吸液过滤器和管道进入泵头以后，导致泵的动作失常。首先，在进液口，随着吸液冲程泵头的压力降低，导致气泡膨胀（见图8）。此时泵吸进的溶剂由于气泡占取一定的空间而降低；其次，在排液冲程时压力增加，气泡又变小，从而使流动相的流量降低。更有甚者，由于气泡的产生和经过的途径、方式都是不规则的，因此不仅

7、影响了流动相流量的准确度，而且影响流量的精度。是否有此种现象产生，可通过泵排液压力的监测加以确认（图9）。当此种现象发生后，无论是保留时间或峰面积都不可能重现（图10），分析的可靠性也就无从谈起。32）泵中形成气泡使液流波动 即使溶剂在容器中，空气并未达到饱和的程度，但溶液进泵以前还可能产生气泡。(1) 低压混合梯度如图11所示，图中虚线圈的部位其压力略低于大气压，因此溶剂在此混合更易产生气泡。低压梯度时，混合室多装在泵后（高压侧）但实际混合过程在低压侧便开始了，故低压梯度较之混合发生在泵后的高压梯度，更易产生气泡。(2) 吸液过滤器的堵塞当吸液过滤器有部分堵塞时，吸液的阻力增大，过滤器内的压

8、力降低，容易形成气泡。吸液过滤器经常清洗，保养，否则易被尘土颗粒等堵塞，有时操作不当也易形成堵塞，例如，在使用缓冲溶液后未进行彻底的清洗，接着就使用盐类溶解度不大的有机溶剂，此时极易造成过滤器孔堵塞。堵塞不严重时，溶剂通过脱气即可。但最好要定时清洗。33）柱中气泡形成和累积引起流动相绕流 色谱柱中的压力一般较高，气体溶解度增大，一般在柱中不易产生气泡。然而，在接近柱的出口处，压力相对较低，此外由于柱箱升温，柱处于较高的温度，气泡也有可能在此形成，另一种可能性是从泵中排出的气泡经过色谱柱时滞留柱中。一但气泡在柱中形成或滞留，如图14所示使流动相液流不稳并产生绕流。 口径交大的色谱柱，一但形成或滞

9、留有气泡后就很难排除。因此，在HPLC实际应用中，HPLC柱的出口端向上，入口端向下，利用浮力尽可能使气泡不停留在柱中。34）检测器池中形成和累积气泡引起基线噪声 当柱箱或检测器池处于较高温度时，检测器池中易产生气泡。因为液流通过检测器时，温度升高而此处的压力反而较小。即使检测器池并未加温，但某些场合下也可能有气泡产生。例如高压梯度时，溶剂混合使气体过饱和，但在前一段流路中，由于压力较大气泡并未析出，一但到了压力接近大压的池中，气泡便会乘隙而出。 如果气泡形成于检测器池中，则将引起如图15所示的尖峰状、锯齿状的基线噪声，甚至于完全无法测定。这种情况下，分析者很难区别究竟哪些是色谱峰，哪些是尖峰

10、状噪声，也无法正确地定义基线的位置，故无法正确地计算出峰面积。 在3-3)和3-4)的场合，如果使用的UV或电导检测器，由于这些检测器能经受较大的压力（约30Kg/cm2）故可在检测器的出口处加一个反压管，使检测器池和柱内的压力适当提高，防止气泡产生。一般反压管使用长2m左右，内径为0.3mm的不锈钢阻尼管。此时对1ml/min的水或甲醇将分别产生2或1Kg/cm2的反压。当然反压的大小与许多因素有关。如果阻尼管内的内径一定，液流是层流的话：(反压)(溶剂粘度)(流量)(阻尼管长) 制备色谱的流量较大，因此阻尼管应较短，内径较大(0.8mm)。另一方面，如果是半微量色谱，流量一般在0.1ml/

11、min左右，上述反压阻尼管将不足以产生所需的压力，此时管径应较细（例如0.2mm），长度可增加至6m左右。 然而，对一些不能承受压力的检测器而言（见表1），则必需事先脱气而不能采用阻尼反压管的方法。 至此，我们讨论了在流路中形成气泡所产生的问题。温度升高，压力降低和溶剂混合是形成气泡的主要原因，图16绘出了系统中温度和压力变化的概况，据此可以估计，在您所使用的系统中，哪些部位容易产生问题。 4、溶解的空气（氧）对检测的影响 形成气泡产生的影响较容易被理解，它往往使压力波动，造成基线噪声。然而，有时溶于溶剂的空气并不形成气泡，但其造成的影响依然是严重的，且不易被发现。41)大量溶解的氧气对检测的

12、影响 溶解于溶剂的气体中，氧气对检测的影响最大，而且是多方面的。即使在当时的温度、压力下，溶解于溶剂的量并不饱和，不足以形成气泡，其影响还是相当严重的。(1) 荧光检测当使用荧光检测器来测定萘、芘等多核芳香烃或维生素E等生育酚时，溶解于流动相中的氧，由于荧光猝灭而影响化合物荧光强度，干扰测定。此时，尽管基线稍有降低，峰高的降低则更为明显。例如，当大量氧气溶于流动相对；测得萘的荧光强度（峰面积）只有完全脱气以后萘的峰面积的25%。(2) 电化学测定，特别是在还原电位下测定时，由于氧的浓度高，产生还原电流使信噪比变差。42)大量或可变的溶解氧对紫外检测的影响 在紫外区，氧本身就有吸收，使测得结果和

13、基线都偏高，例如在210nm饱和有空气的甲醇（氧的分压 0.2大气压）在过氦脱气以后，基线可降低0.32吸收单位（图18）。由引可见，经过脱气可大大降低紫外区的背景。另一方面，氧气的存在不仅使基线变高，而且当氧气的浓度随着压力、温度等诸因素变化而变化时，将使基线波动十分严重。由上例可知，如果在满标尺 0.01吸收单位测定时，氧的浓度变化1%，将引起基线相当于30%满标尺的变化。此外，当使用含氧的甲醇等作梯度洗脱时，随着流动相甲醇的含量增多而升高的基线，有可能影响进一步的数据处理（见图19） 溶解氧的影响在短波区较为明显，但也与溶剂种类有关，例如溶解氧对四氢呋喃的影响一直延伸至254mm处，在2

14、54 mm处，溶解氧的影响由四氢呋喃，甲醇、乙腈、水逐渐降低。就乙腈而言，即使在较短长区影响也不明显。因此，同样的氧气浓度、对不同的溶剂其影响也不同，可见其吸收的增 加并非完全由于自身的吸收，也许还与氧与溶剂杂质之间的某些反应有一定的关系。 进行紫外波外区高灵敏测定时，一般采用乙腈较好，如果为了提高分离效率，则一定要控制好溶解氧的量，换言之，必须采用适当的脱气手段。43）溶解空气量的变化引起示差检测时的基线漂移 折射率不仅与液体中固体或液体溶质的浓度有关，也与气体溶质的浓度有关。因此，由于温度变化而引起气体溶解量的变化，将使折射率基线漂移波动。例如以四氢呋喃为溶剂，在满标尺为810-6折射率单

15、位的情况下测定时，溶剂中空气的溶解量改变1%，则导致10%以上的基线变化。要抑制此种干扰，需使流动相处于恒温，或用氦置换溶解的其它气体，相对而言，氦的溶解度随温度的变化较小。 综上所述，即使未形成气泡，溶解的空气对测定还是有影响的。5、脱气方法 前几节阐述了流动相脱气必要性，本节将介绍有关的脱气方法，脱气方法可分为在线脱气和非在线脱气。 非在线脱气是流动相使用以前，事先脱气的方法，流动相使用过程中，空气再次溶解进入流动相，故脱气并不充分。在线脱气法是流动相使用前或（和）使用中连续脱气的方法，分析中不必取下再次脱气，分析的可靠性提高。不同的脱气方法各有优缺点，下面将分别说明。51）加热和搅拌（1

16、） 如前所述，低温时空气在溶剂中的溶解较大，故由于各种原因，温度较低（混合过程的吸热反应导致液温降低，早晨温度较低或从贮存室取出的溶剂等）的溶剂在较高的室温中使用，使溶剂中的过饱和。此时可通过加温和搅拌的方法，降低溶剂中空气的含量。此外，如果溶剂温度低于室温，随着温度变化，密度也随着变化，使流量的重现性变差。本法也可用作氦脱气和渗气性薄膜真空脱气等在线脱气的前处理。步骤拧松流动相溶剂容器的盖子，置于略高于室温的水浴中，隔一段时间，取下容器，加盖以后猛烈振荡，然后开盖放气，再置入水浴中。如此反复，直至流动相的温度略高于室温止。擦干容器即可使用。优点方法简单易行，不必特殊的装置。缺点只能脱气至当时

17、温度下的饱和点，故不适用于低压梯度洗脱和某些高灵敏度的分析。应用用于正常灵敏度的紫外、示差和荧光检测。如果柱和检测池加温或高压梯度时，最好用反压管，适当提高柱出口池的压力。此时，建议将流动相容器提高，并采用气泡捕获器（见5-6）52）吸气装置减压脱气 本法一般用于快速除去过量的溶解空气。步骤把流动相容器的盖子打开，接上吸气装置，在搅拌或超声波振荡的情况下减压脱气。当小气泡猛烈逸出即可。抽吸过度产生的大气泡并非完全是空气，而是减压沸腾的流动相。 当吸气装置抽吸时，与液面接触的气体主要是溶剂蒸气。氧气的分压很低，故用此脱气很容易使溶剂中的空气量降至饱和点以下。脱气后，流动相在使用过程中与空气接触，

18、又可能再次溶入空气。此外，在抽吸过程中，由于大量溶剂挥发而以气化热的形式吸收热量，使溶剂能溶解量降低。优点脱气的速度很快。缺点持续减压的情况下，如流动相是混合溶剂易产生分馏，改变流动相的组成。 在以示差检测器或某些场合紫外检测器测定时，由于氧气慢慢溶入导致基线漂移。 应用适用于一般灵敏度的紫外和荧光检测。在检测器和色谱柱加温的情况下，或高压梯度时，有必要采用反压管。不适于高精度分析，因为温度的改变可能导致溶解气体量的变化。且溶剂组成可能改变。 在电化学和电导测定时，溶剂只是水溶液，故脱气较充分的话，溶剂可供使用几小时。53）加热和搅拌（2） 本法是一种在线的脱气方法。由于流动相可维持与柱箱或检

19、测器池相同的温度，如溶剂的组成不因脱气而变化，将无气泡产生，故此法用于示差检测时，基线可相当稳定。本法随着温度升高脱气能力提高，但必需注意，如果温度过高溶剂沸腾产生气泡进入吸液过滤阀就很麻烦。此外有必要控制吸液管和泵头的温度。步骤如图23所示，将溶剂容器接上回流装置以后，置于水浴中，然后在搅拌的情况下加热。最好采用控温精度较高的加热装置。优点在线脱气，可控温使流动与柱温、检测器池相近，故控制气体溶入量较好，较为稳定。缺点装置体积大，流动相必需置于能与回流装置匹配的容器中。 如果是混合溶剂，有可能使溶剂的组成发生变化。 达到稳定需较长时间。 脱气成本高。应用可用于示差、电导、电化学检测器的高精度

20、分析。 如果能允许升至较高温度，适用于高精度的紫外和荧光检测。54）渗气性薄膜真空脱气本法采用简称为脱气机的装置（图24），装于流动相容器和泵之间，应用相当广泛。渗气薄膜外的真空象提取器似的把流动相中分子体积较小的氧和氮分子抽出。约85%95%的溶解空气可以被除去，气泡将不可能再形成，本法也适用于高灵敏度的测定。步骤把脱气装置接于流动相容器和泵之间，通溶剂3045ml (约23倍的脱管体积)，然后提起吸液过滤阀吸5秒钟空气，再置入流动相，从泵的排液阀观察刚才吸进的空气是否排出，以此估计置换体积。如此重复，直至流动相充满流路为止。优点作为一种在线脱气的方法，对流动相容器及盖子无特殊要求。 即使流

21、动相是混合溶剂，也不会以分馏的形式改变流动相的组成。操作成本低。 容易掌握使用。缺点脱气能力受流量制约*。 随着真空泵的关闭，脱气能力有所改变*。*脱气能力随流量增加而降低。如果以纯甲醇作流动相，在210mm 检测时，吸收将随流量增加而增加（见图28）。此外在高压梯度时，例如甲醇和水，基线吸收会有波动（见图29）*有两种真空泵，当真空室中压力降至一定程度时，第一种泵将继续以一定的速度旋转；第二种则停止工作，直至真空度下降至某一水准再启动。第一种泵脱气时，需很长时间才能达到稳定，故多数商品化的此类脱气装置都采用第二类的泵。因此，由于泵的启动和关闭，引起真空度的变化进而造成某些场合的基线波动（见图

22、30）。此时为了改善基线，可采用串联的办法（见图31）把几个流路串起来。 应用高压、低压梯度洗脱分析时，高精度定性（保留时间）分析。 电导、荧光、电化学检测器高灵敏度分析。 高灵敏度紫外可见检测，但不适用于对氧气浓度特别敏感的波长和溶剂。 一般灵敏度的示差检测。55）氦脱气与多种其它气体比较，氦在各种溶剂中的溶解度最小，且溶解度随温度的变化也最小。当在一定压力下，使氦在溶剂中冒泡时，即可将其它溶解气体驱走，本法脱气能力很强，适用于对氧的浓度很敏感的高灵敏紫外，荧光和示差检测，可得到相当平稳的基线。但是，氦脱气时容器要尽可能加上盖子，避免溶剂与空气随意接触，一方面是因为氦冒泡脱气时不可能把溶解的

23、其它气体全部驱尽，另一方面，当氦的压力变化，导致气体分压变化后，使脱气程度波动，基线也随之波动。步骤氦脱气装置如图35所示，是一种密封耐压系统。注意，流动相容器用一种特殊的盖子密封（如DGU-10A等一些脱气装置的此种密封盖是标准附件）。先通氯气1030分钟，压力0.20.5Kgcm2以驱走流动相中溶解的空气。此后关闭排气阀即可使用。此时调节氦气压力稍大于大气压，再进入的氦气只置换被用去的流动相的体积。当分析完毕以后，先打开排气阀，再调节压力至零，如果有进口阀的话，关掉。此时氦可能通过出口管逐渐逃逸（管中有压力可防止空气进入），流动相可能会通过氦出口过滤倒流。如果装置中有阻尼管，则能通过空气倒

24、流，防止流动相倒流，如果无阻尼管则干脆松开氦出口管，让空气流入。如果压力调节阀失灵，装置内的安全阀启动压力又设置过高，则流动相容器内的压力太大，引起危险。因此，除适当设置安全阀启动压力等，为确保安全，加压容器最好如图37所示加以屏护，以防万一。本公司DGC-10A等氦脱气装置中，作为标准装备，包括上述屏护材料。溶剂气体阱用以收集驱气过程中挥发的溶剂气体，避免其逸入室中。如果氦脱气采用开口系统，则达到相应的气液平衡，不会有大量流动相蒸气逸出。优点脱气能力最强 脱气能力与流动相流量无关。缺点需氦气钢瓶，气体压力表等装置。 如果非密封加压系统，不一定能确保脱气的效果，因此对流动相容器的瓶口直径和形状

25、有特殊要求。 如果流动相是混合溶剂的话，溶剂的组成有可能变化。如果是密封加压系统，达到平衡后，溶剂组成不易变化。应用用于各种高灵敏检测，紫外高灵敏检测需采用密封加压系统；开口系统可用于荧光，电导及电化学等高灵敏检测。 适用于高压或低压梯度洗脱。高精度分析时，脱气的溶剂最好不是混合溶剂，操作成本很大程度上取决于所采用装置的结构，如封闭加压系统或开口系统。以岛津DGU-10A密封加压系统为例（可四流路脱气）；如采用二流路，流动相容器2个11瓶；每天脱气8小时，氦的压力 0.3Kg/cm2，初始驱气20min，99.995%He，7m3每瓶2000元计则： 初始驱气300ml/min2min2=12

26、l 正常操作10ml/min（漏气）480 min=5l 置换流动相体积约2l故每天的操作成本为：19l2000/7000=5.5元 56）非脱气的方法除了脱气以外，还有一些其他方法可降低气泡的危害：(1)提高流动相容器(2)使用气泡捕获器。提高流动相容器如图38所示，把流动相容器置于比泵高的地方，使泵的入口处稍有压力，可防止逆阀的误动作（正常情况下逆阀作用不大）。在压力下，即使有气泡进入泵，也占体积较小；此外，气泡体积小，容易凭借吸液管中的浮力上浮，不易进入泵中。因此，提高流动相容器是一种简单易行且有效的措施，无论采取脱气与否，这样做都有益无害。气泡捕获器在泵与流动相容器之间设置如图39所示

27、的气泡捕获器可防止吸液过滤器形成的气泡进入泵体。气泡捕获器也有缺点，首先流动相清洗捕获器既需时间也需流动相，其次在低压梯度或有在线脱气装置时无法应用。上面讨论了各种脱气方法及各方法的优缺点及应用范围。在实际工作中，请视具体情况采用最适宜的方法。6一些不同分析条件下的有效措施前面的章节中，我们讨论了各种脱气方法及其应用，一般情况下，采用加热搅拌和提高流动相容器等措施已足够了。在某些检测条件下，欲得到高度稳定的基线，除考虑使用在线脱气方法以外，还要采取其他相应措施。61）在反相色谱、紫外检测时如何获得高稳定的基线高效液相色谱中，用得最广泛的是ODS等反相柱及紫外可见检测器，如果要在近紫外区进行高灵

28、敏检测，还要注意下列方面。（1）彻底清洗HPLC流路和色谱柱 用流动相清洗一天实际上无必要，更有效的方法是用洗脱液清洗而不是用流动相清洗。例如：对一些油污染或憎水性组分，可用四氢呋喃；对吸附于硅胶表面的物质，可用0.5M的高氯酸钠，含4:1磷0.01%的溶液清洗；对一些金属离子，除了色谱柱以外，可用0.1%EDTA二钠盐清洗。手动进样器的流路切换阀。请放在各个位置上多次清洗。至于吸液过滤阀的清洗，请参考前文。（2）使用低背景的流动相试剂 图41、42、43、分别是乙腈、甲醇和四氢呋喃的吸收光谱，这几种试剂是反相色谱常用的流动相。在短波长区，乙腈的背景最低；甲醇和四氢呋喃的背景较高，且背景大小随

29、溶解氧含量变化而变化，不太适宜于高灵敏度的分析。当然，分离的选择性以及峰形与所选的溶剂有关。但是，只要有可能，请尽量选取乙腈作流动相。某些用作缓冲液的有机酸，例如乙酸或用于吸附抑附的胺类如三乙胺，在短波长区也有较高的吸收，故尽可能用磷酸缓冲液和高氯酸钠作吸附抑制剂。无论是缓冲液或抑制剂，总是新鲜配制的为好。此外，水也是流动相，也要选用纯度高的蒸馏水。（3）采用高灵敏检测器 很自然，检测器的噪声总是越低越好。（4）使用在线脱气 即使采用了背景最低的乙腈作流动相，在线脱气（如密封加压氦脱气系统）还能把背景降低一点。 本节阐述的四点，以其重要性逐次排列。其中第一和第二点是非仪器因素，在实际工作中不一定都能找到合适的答案，因此还要具体情况具体分析，力争圆满解决。62）示差检测器分析糖类时如何获得高稳定的基线紫外检测器在液相中应用最为广泛，但糖类分析或在凝胶色谱（空间排斥色谱）中，主要采用示差检测器，一般而言，示差检测器的基线稳定性较差，不能令人满意，但许多场合真正的罪魁祸首是流动相中溶解的空气以及柱温的波动。(I)配位交换柱(Shim-packSCR101P等)使用此类色谱时，为了得到好的色谱，分析柱温一般设在80。因此，即使空气在流动相容器中已饱和