泛素化蛋白修饰ppt课件

1、泛素化蛋白修饰ProteinModificationbyUbiquitination北京协和医学院研究生课程：细胞信息与调控2010年10月13日,TheCentralDogma（Revised),E1,-E1,E2,-E2,底物,E3,ATP,AMP+PPi,Ub,Ub,Ub,泛素蛋白酶体通路,Ub:泛素(Ubiquitin)，一高度保守的，由76个氨基酸组成的多肽。E1:泛素激活酶(Ubiquitin-activatingenzyme)，人类仅有2种E1。E2:泛素载体蛋白(Ubiquitin-carrierprotein)，人类约有30种E2s。E3:泛素蛋白连接酶(Ubiquitin-

2、proteinligase)，人类有500多种E3s。,9,泛素化(ubiquitination)即蛋白质被泛素(ubiquitin，由76个氨基酸组成的多肽）共价修饰的过程，在几乎所有的真核细胞活动中起着关键作用。泛素蛋白酶体(proteasome)通路则是真核细胞内最主要的蛋白质降解途径。泛素化调控的细胞活动至少包括:细胞周期（Cellcycleprogression）细胞凋亡（Apoptosis）转录调控（Transcriptionalregulation）DNA修复（DNArepair）免疫应答（Immuneresponse）蛋白质降解及质量控制（Proteindegradationa

3、ndqualitycontrol),2,TheNobelPrizeinChemistry2004forthediscoveryofubiquitin-mediatedproteolysis,AaronCiechanoverAvramHershkoIrwinRose阿龙.西查诺瓦阿夫拉姆.赫希科欧文.罗斯,3,近年与泛素蛋白酶体相关的PubMed论文数在持续增长,4,篇数,年份,本专题内容,1.泛素蛋白酶体通路的组成及重要性2.泛素化与泛素化酶3.去泛素化酶4.泛素化异常与人类重大疾病的发生5.蛋白酶体构成6.蛋白酶体抑制剂与药物7.调节蛋白酶体活性的新机制8.类泛素蛋白（SUMO,NEDD8,

4、ISG15,APG8,APG12，PUP等）,5,中国协和医科大学出版社，2008年,泛素介导的蛋白质降解Ubiquitin-MediatedProteolysis主编：邱小波王琛王琳芳,参考书,陈竺和诺贝尔奖得主AaronCiechanover作序,蛋白质泛素化研究简史,1975年，Goldstein误将泛素（Ubiquitin)当作胸腺激素而发现。1977年，Goldknopf和Busch认定组蛋白2A与泛素以异肽键（IsopeptideBond）结合。1977年，Goldberg证明人类细胞中存在一可溶的，直接依赖于能量的非溶酶体类蛋白酶。1978年，Ciechanover和Hershk

5、o发现了APF-1是Goldberg系统中蛋白酶系的必要成分，结果发表在BBRC。1980年，Ciechanover，Hershko和Rose等人证明了APF-1与当时已被发现的泛素是同一物质。1984年，Finley和Varshavsky等发现泛素在细胞周期中的重要性。1987年，Goldberg和Rechsteiner两个小组几乎同时分离出分子量很大的依赖于ATP并降解泛素化底物的蛋白水解酶。1988年，Goldberg将这种蛋白水解酶命名为Proteasome（蛋白酶体）。1997年，Yeh等小组发现类泛素蛋白SUMO和NEDD8的功能。2003年，美国FDA批准了用Velcade来治疗

6、多发性骨髓瘤；Velcade是在Goldberg发明的蛋白酶体抑制剂MG132的基础上研发而成的。2004年，Ciechanover，Hershko和Rose因发现泛素介导的蛋白质降解共同获得诺贝尔化学奖。2008年，Darwin等在细菌中发现类泛素化修饰。,7,Figure8-34Ubiquitin(泛素）,泛素由76个氨基酸残基组成，其中包括7个赖氨酸残基(K),其C末端可与底物的赖氨酸残基形成异肽键，从而引起底物泛素化。泛素的K11、K29、K48和K63均能参与形成泛素与泛素间的异肽键(Isopeptidebond)。,E1与ATP结合后，催化泛素羧基末端腺嘌呤化，同时释放无机焦磷酸（

7、PPi）。E1活化位点的半胱氨酸硫醇激活泛素腺嘌呤核苷酸中间产物上的羧基，形成一个泛素硫酯键。E2激活的重要条件是位于UBC结构域的一个保守半胱氨酸催化位点与泛素羧基端形成一个硫酯键。E3催化被E2活化的泛素C-端甘氨酸与底物或下一个泛素的赖氨酸间形成泛素异肽键(Isopeptidebond)。,11,调节蛋白质内吞，修饰和转录,靶蛋白必须经多聚泛素(多于4个泛素分子)修饰才能被蛋白酶体识别与降解。,泛素化模式（UbiquitinationModes）,调节蛋白质的活性和定位,K48polyubiquitylation,K63polyubiquitylation,Monoubiquitylat

8、ion,Multiplemonoubiquitylation,12,a.RINGfingerdomain（SCF复合体，APC，MDM2，Parkin,和c-Cb1）b.U-boxdomain（CHIP)c.HECTdomain（能与底物形成硫酯键)d.N-EndRule,E3的种类,13,E3泛素连接酶以单体和复合体两种形式存在,14,AmerikandHochstrasser,2004,去泛素化作用（Deubiquitination）,15,泛素-C-末端水解酶，通常参与蛋白降解后泛素分子的再利用及对多聚泛素链的修饰，也参与由泛素前体产生泛素单体的过程（如UCH37、UCH-L1)。泛素特

9、异性蛋白酶，参与去除蛋白质上的多聚泛素链，也可从短泛素链的末端去掉单个泛素（如USP8)。去泛素化酶属半胱氨酸蛋白酶，目前已发现90多种。,去泛素化酶可分为两类：,去泛素化酶(Deubiquitinatingenzyme),16,泛素化途径的异常与人类重大疾病,神经退行性疾病（如帕金森氏症）：Parkin,UCH-L1癌症:BRCA1,CYLD,Mdm2,Nrdp1,pVHL传染病病原体的入侵、致病机制:E6-AP,17,泛素连接酶Parkin的失活与帕金森氏症（AR-JP),CurrentOpinioninNeurobiology2004,14:384389,18,CurrentOpinio

10、ninNeurobiology2004,14:384389,ParkinSubstrates,19,UCH-L1为一去泛素化酶，它在帕金森氏症病人中的突变可能导致其酶活性的丧失，减少了泛素自由单体的供应及底物蛋白的降解，进而导致黑质病变。,帕金森氏症中的去泛素化,20,失调蛋白底物修饰肿瘤类别SKP2p27(KIP)PolyubiquitylationMalignantmelanomaMDM2p53PolyubiquitylationNon-small-celllungcancer,soft-tissuecarcinoma,colorectalcancerHAUSPp53,MDM2De-ubi

11、quitylationNon-small-celllungcancerlymphomaAPCCyclinB,PolyubiquitylationColorectalcancersecurinFANCLFANCD2MonoubiquitylationFanconianaemia-relatedcancersCYLDIKKDe-ubiquitylationCylindromatosisIAP2BCL10PolyubiquitylationMALTlymphomasCBLRTKsMultipleLymphoma,AMLandmonoubiquitylationgastriccarcinomapVHL

12、HIFPolyubiquitinationvonHippel-Lindaudisease,泛素化失调与肿瘤,21,CYLD具有TRAF2（TNF-receptor-associatedfactor2，为IB的泛素连接酶)结合位点，可促进IB的去泛素化。,去泛素化酶CYLD的突变与圆柱瘤Cylindromatos的发生相关,22,CYLD促进IB的去泛素化，从而抑制NF-B的活性,23,NENGLJMED2004,350:187-188,圆柱瘤Cylindromatos也称“头帕肿瘤综合症”(turbantumoursyndrome),其患者细胞CYLD的两个等位基因都发生了突变，结果使患者细胞

13、中CYLD丧失功能，导致核转录因子NF-B的过度活化；启动基因的转录，导致细胞的过度增殖,24,泛素连接酶Mdm2和E6-AP与p53的降解和癌症,25,UbiquitinationoccursonhistonesH1,H2A,H2BandH3.Thismodificationondifferenthistonesplaysdistinctrolesinregulationofchromatinstructures,andhencegeneexpressionandgenomestability,Ubiquitinationandtranscriptionalregulation,Ubiqui

14、tinationofhistoneH2AandH2Bhasoppositeeffectsontranscription.UbiquitinationofH2Bisassociatedwithgeneactivation,whileH2Aubiquitinationcontributestogenesilencing,Wangetal.,NATURE|VOL431|14OCTOBER2004,Leeetal.,Cell131,10841096,2007,HistoneCrosstalkbetweenH2BMono-ubiquitinationandH3MethylationMediatedbyC

15、OMPASS,Cps35IsRequiredforTranslatingHistoneCrosstalkbetweenH2BMonoubiquitinationandH3MethylationbyCOMPASS,1.Nrdp1是一新的含有RINGfinger结构域的泛素连接酶。,Nrdp1是一促进ErbB3及BRUCE泛素化和降解的泛素连接酶,2.ErbB3是表皮生长因子受体家族(EGFRfamily)成员之一，在生长，发育及细胞存活中起着关键的作用。该家族与许多肿瘤密切相关，已成为癌症治疗的重要标靶之一。3.BRUCE/Apollon是一含有BIRdomain（凋亡抑制蛋白的标志性结构域）和

16、E2domain的巨型(530kDa)膜蛋白,26,Nrdp1促进细胞凋亡并可能与癌症和帕金森氏症相关,1.Qiu*&Goldberg*(2002),PNAS2.Qiu*etal.(2004),EMBOJ3.Qiu*&Goldberg*(2005),J.Biol.Chem.4.Liu,Qiu*etal.Manuscriptinpreparation,27,本专题内容,1.泛素蛋白酶体通路的组成及重要性2.泛素化与泛素化酶3.去泛素化酶4.泛素化异常与人类重大疾病的发生5.蛋白酶体构成6.蛋白酶体抑制剂与药物7.调节蛋白酶体活性的新机制8.类泛素蛋白,28,TheBiochemicalRoles

17、ofProteinDegradationinaCell,1.溶酶体(Lysosomes)Non-selectiveHydrolyzeproteinsfromautophagyDigestproteinsfromendocytosisMembraneproteinsExtracellularproteins2.泛素-蛋白酶体通路Selectiveand(Ubiquitin-ProteasomePathway)ATP-DependentRegulatebiochemicalreactionsDiscardunnecessaryproteinsDegradedamagedormisfoldedpro

18、teinsPresentinternalizedantigensinimmunologicalresponses,29,20S催化颗粒,19S调节颗粒,19S,10nm,电镜下的26S蛋白酶体(Proteasome),YifanCheng,Xiao-BoQiuetal.,unpublisheddata,30,26S蛋白酶体的亚基组成,31,32,免疫蛋白酶体(Immunoproteasome)负责抗原提呈(AntigenPresentation),免疫蛋白酶体的催化颗粒(20S)有三个特殊亚单位LMP2、LMP7和MECL-1。其调节颗粒为PA28（11S）。,20S颗粒,33,MHCclas

19、sIantigenpresentationpathway,Tcell,PeptideMHCclassI,Proteinantigen,Proteasome+/-Ubiquitin,Peptides(2-24a.a.),TAP(8-16a.a.),EndoplasmicReticulum,CD8+,Golgi,8-10a.a.,Aminoacids,ERAP1,34,35,Theproteasomeinhibitor,Velcade(Botezomib/PS-341),hasbeenapprovedbyFDAtotreatmultiplemyelomaandmantlecelllymphoma.

20、,36,中药雷公藤中的抗癌活性成分雷公藤红素Celastrol是一种蛋白酶体抑制剂，它能通过控制癌细胞的蛋白酶体活性进而诱发癌细胞凋亡。Yang,H.etal.,CancerRes.(2006),37,1、蛋白酶体亚单位hRpn13能激活存在于蛋白酶体的去泛素化酶UCH37。2、c-Abl通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性。,蛋白酶体的调控,38,hRpn13能激活去泛素化酶UCH37,control,+hRpn13,S5a,+hRpn13+Ub-H,Qiu,X.B.*etal.,EMBOJ.（2006）25:5742-5753.,39,其它研究表明Rpn13可作为泛素受体而结合于泛素链的近端

21、,Husnjaketal.Nature453:481,2008Schreneretal.Nature453:548,2008,41,c-Abl通过引起蛋白酶体磷酸化而抑制其活性,Liu,X.,Huang,W.,Li.,C.,Li,P.,Yuan,J.,Li,X.,Qiu,X.B.,Ma,Q.,andCao,C.(2006).MolecularCell.22,317-327.,42,The26Sproteasomeisamultisubunitcomplex,consistingofthe20Scatalyticparticleandthe19Sregulatoryparticle,andsel

22、ectivelydegradesubiquitinatedproteinsinthepresenceofATP.Proteasomesareresponsiblefordegradationofmostcellularproteins,whilelysosomesdegradeextracellularproteinsandmostmembraneproteins.Uponimmuneresponses,cellsgeneratespecialtypesofproteasomes,immunoproteasomes,whichpossessdistinctregulatoryparticle(

23、11S)andcatalyticparticle(withdifferentcatalyticsubunits),formoreefficientantigenpresentation.,Proteasomesareresponsiblefordegradationofmostcellularproteins,本专题内容,1.泛素蛋白酶体通路的组成及重要性2.泛素化与泛素化酶3.去泛素化酶4.泛素化异常与人类重大疾病的发生5.蛋白酶体构成6.蛋白酶体抑制剂与药物7.调节蛋白酶体活性的新机制8.类泛素蛋白（SUMO,NEDD8,ISG15,ATG8,PUP等）,43,类泛素蛋白及其同源性,44,

24、Ubiquitin-LikeProteinInvolvedintheProteasomePathwayofMycobacteriumtuberculosisPearceetal.(2008)Science322:1104PUP-conjugationisfoundremarkablyinmycobacteriaandalliedactinobacterias,andissporadicallypresentinotherlineages,suchasverrucomicrobia,nitrospirae,deltaproteobacteriaandplanctomycetes.Iyeretal

25、.(2008)BiologyDirect,3:45,Proteinmodificationbyubiquitin-likeprotein,PUP,inprokaryotes,PUPispredictedtoencodea64aminoacidproteinwithamolecularsizeof6.9kD,类泛素蛋白的结构高度相似,Ubiquitin,ISG15,Sumo,NEDD8,45,ActivatingenzymecomplexhastwosubunitsAOS1issimilartotheN-terminalhalfofUbE1UBA2ishomologoustotheC-termi

26、nalhalfofUbE1andcontainsthecysteinenecessaryforlinkagewithSUMOConjugatingenzyme:UBC9,SUMO(Smallubiquitin-likemodifier)101aminoacids,46,SUMO修饰的功能,47,SUMO化修饰的底物,48,Desumoylatingenzymes,Ulp1HasbothisopeptidaseandC-terminalhydrolaseactivityRequiredforG2/MtransitionSumoC-terminalhydrolases,e.g.SENP1,49,N

27、edd8(neuralprecursorcell-expresseddevelopmentallydownregulated)-81residues,Activatingenzymecomplex(2subunits)-APP-BP1andUBA3TheAPP-BP1N-terminalhalfishomologoustotheN-terminalhalfofubiquitinE1UBA3ishomologoustotheC-terminalhalfofubiquitinE1andcontainsthecysteinerequiredforthiolesterlinkagewithNedd8,

28、Conjugatingenzyme:UBC12,50,FunctionofNeddylation,Substrates(SCFcomponents)Cdc53inyeastCullinfamilymembersinhumans,51,Crystalstructure,52,Deneddylation:COP9Signalosome(CSN),500kDaproteincomplex8distinctsubunitsCSN5/Jab1iscatalyticcomponentofisopeptidaseHomologytosubunitsoftheproteasome(CSN5=RPN11),53

29、,OtherNEDD8-specifichydrolasesandisopeptidases,UCH-L3hasNEDD8C-terminalhydrolaseactivityUSP21deconjugatesubiquitinanddeneddylatesfromNEDD8conjugates,54,ISG15(Interferon-stimulatedgene15),Inducedbyinterferon,lipopolysaccharides,oruponviralinfectionsE1(ISG15activatingenzyme)UBP43,ISG15-specificisopeptidaseModifiedproteins:JAK-STATproteins,55,Aut7/Apg8/ATG8inAutophagy,Aut7/Apg8isnecessaryforformationo