第七章抗原抗体反应

1、第五节常见免疫分析方法,凝集反应、沉淀反应、中和反应、补体参与的反应等。,一、抗原抗体反应类型,一）凝集反应：1、定义：颗粒性抗原与相应抗体相遇后，在电解质参与下出现肉眼可见凝集物的现象。,2、参与要素：凝聚原：参与凝聚反应的抗原，如：血细胞、菌体等。凝聚素：参与凝聚反应的抗体。,3、类型,直接凝集反应（定性实验，检测抗原或抗体）：颗粒性抗原与相应抗体在有电解质时，直接结合所出现的凝集现象。,常用方法：A、玻片法：细菌及ABO血型鉴定（标准血清检测抗原）B、试管法：肥达氏反应（伤寒或副伤寒杆菌标准液检测血清）,间接凝集反应（检测可溶性抗原或抗体）：将可溶性抗原吸附于与免疫无关的小颗粒（载体）表

2、面后，与相应的抗体在电解质存在的下而发生的凝集反应。,常用载体颗粒：红细胞人（O型）和动物（绵羊、兔鸡等）、胶体颗粒、聚苯乙烯乳酸、活性碳等,间接血细胞凝集试验：以红细胞作为载体的凝集反应。,凝集抑制实验,将可溶性抗原与相应抗体预先作用，然后再加入致敏颗粒（吸附相同可溶性抗原的乳胶颗粒）,由于抗体已被可溶性抗原结合,因而致敏颗粒不发生凝集现象。如免疫妊娠实验测验尿中HCG（乳胶凝集抑制试验，无凝集者为阳性）。,二）沉淀反应：1、定义：可溶性抗原与相应抗体在一定条件下，出现细微沉淀物的现象。,2、参与因素：沉淀原：参与沉淀反应的抗原。包括：蛋白质、多糖和类脂溶液、血清、细菌抽提液、组织浸出液等。

3、,沉淀素：参与沉淀反应的抗体。,3、类型：,环状沉淀反应：将已知抗原（抗体）注入特制小试管中，再沿管壁徐徐加入适量抗体（抗原），在两液界面出现白色的沉淀圆环的现象。,絮状沉淀反应：将已知抗原与抗体在试管内混匀后，出现肉眼可见的絮状沉淀的现象。,凝胶扩散试验：利用可溶性抗原、抗体在半固体琼脂内扩散，在其扩散的某一部分出现白色沉淀线的现象。,凝胶扩散实验分为：单向琼脂扩散（定性、定量分析）双向琼脂扩散（定性分析）,三）中和反应：抗体使相应抗原（毒素或病毒）的毒性或传染性丧失的反应。,抗毒素：使相应毒素失去毒性的抗体。,中和抗体：使相应病毒丧失传染性的抗体。,中和反应应用：毒素或病毒种型的鉴定与抗原

4、性分析；抗毒素或中和抗体的效价测定。,四）补体参与的反应,1、反应特点：抗原抗体复合物激活补体，被活化的补体成分可与抗原抗体复合物结合；补体被复合物结合后即被消耗。,2、反应类型,1）溶菌反应：某些革兰氏阳性菌，与相应抗体结合后，形成抗原抗体复合物，在加入补体，则出现的细菌溶解现象。,2）溶血反应：红细胞与相应抗体特异性结合后，在有足量补体存在条件下，出现红细胞溶解的现象。,3）补体结合反应：在补体参与下，并以绵羊红细胞和溶血素（抗绵羊红细胞的抗体）为指示系统的抗原抗体反应。,3、补体结合反应系统：检（待）测系统：待测的抗原+抗血清（抗体、补体）指示系统：绵羊红细胞（抗原）+溶血素（抗体）补体

5、系统豚鼠的新鲜血清,4、反应过程,1、免疫分析的定义：利用抗原抗体的特异性反应的特性对抗原或抗体进行量和质的测定分析。,二、常见免疫分析方法,特异性强灵敏度高反应速度快,2、特点：,一）免疫沉淀,1、环状沉淀反应,应用：抗原抗体的定性及定量分析。方法：试管法，玻片法,常用已知抗体来检测未知抗原。定量实验时，由于抗原分子小，反应面积大，且为保证Ag与Ab的适宜比例，有足够的抗体参与反应，操作上通常是稀释抗原（上层），而不稀释抗体（下层）与图示相反,2、凝胶扩散沉淀,1）单向扩散法（Mancini法）：将抗血清均匀地混合于琼脂糖凝胶（浓度为：0.81%）内，倒平板，平板打孔，孔中加入待测的抗原样品

6、，抗原呈辐射状向含抗体的胶内扩散，至抗原与抗体的量达一定比例时形成可见的沉淀环。,一定条件下沉淀环的直径或面积与相应的抗原含量成正比。,应用：,定性与定量分析，常用于测定血清中IgG、IgM、IgA及补体的含量。,2）双向扩散法（Ouchterlony法）：在琼脂糖凝胶平板内打两排孔，孔中分别加入抗原、抗体，抗原、抗体分别呈辐射状向含胶内扩散，当抗原与抗体在胶内相遇，且二者的量达一定比例时则形成可见的沉淀线。,应用：,定性分析：鉴别抗原与抗体反应间的特异性如何：根据相邻孔中不同抗原与同一抗血清反应形成的沉淀线形状的变化判断抗原间是否存在共同的AD。,定量分析：测定抗血清效价及抗原的最佳浓度。,

7、双向免疫扩散定量分析：测定抗血清效价及抗原的最佳浓度,表中代表出现沉淀线的强度，如：1:8、1:16抗体出现中等浓度沉淀线，1:32出现较弱的沉淀线。,抗血清的效价为,最佳抗原浓度为：,1:16,1:16,3、免疫电泳：利用蛋白质在凝胶中电泳移动速率不同而被分离的特性与免疫琼脂扩散结合起来的分析方法。,2）特点：加快反应速度；提高免疫沉淀的灵敏度。,3）免疫电泳的方法,血清免疫电泳,1）原理：PH8.6时，混合蛋白抗原多数带负电，向正极移动（少数带正电的则向负极移动），不同抗原分子因大小及所带电荷不同，其电泳速度不一样而被分离。,A、方法：,先将抗原进行电泳，分离成不同的区点（带）；,在琼胶中

8、沿电泳方向挖一平行小槽，加入抗血清，让抗原和抗体进行自由扩散，两者在合适的比例下形成沉淀弧。,B、操作步骤：,根据各蛋白所处的电泳位置，可分为：白蛋白区、球蛋白1区、球蛋白2区、球蛋白区、球蛋白区,沉淀弧可显示样品与对照血清蛋白组分的增加或减少情况,正常血清,待测抗原,对流免疫电泳（电渗析）：在电场的作用下，抗原、抗体进行相对运动，具有定向加速度的免疫双扩散技术。,方法及原理：琼脂板上打两排孔，负极孔加待测抗原，正极孔内加相应抗体，通电后，带负电荷的抗原泳向正极抗体侧，而抗体（PH8.6时带负电）藉电渗作用流向负极抗原侧，在两者间形成沉淀线。（电渗：电场中液体对于固体支持物的相对移动）,琼脂中

9、含SO42-，带负电，其静电感应使附近水带正电，而向负极移动。电泳时有电泳力和电渗力两种力。若物质原来带正电，向负极移动，则因电渗作用向负极移动得更快。若物质向正极移动，所带电荷少，电泳力小于电渗力，也向负极移动，如：血清中的球蛋白,抗原和抗体在电场中相向运动,火箭电泳：在电场的作用下，进行的免疫单向扩散技术。,A、方法及原理：在含抗体的琼脂板负极端打一排抗原孔；加入抗原进行电泳，抗原泳向阳极，在抗原抗体比例恰当处发生结合沉淀。,B、反应特点：随着泳动抗原的减少，沉淀逐渐减少，形成峰状的沉淀区，形状似火箭。抗体浓度保持不变，峰的高度与抗原量呈正比。,抗体的量一定沉淀线高度与抗原量成正比,二）免

10、疫标记技术,（一）放射免疫分析（RIA）：用放射性同位素标记的抗原或抗体，通过免疫反应来进行测定的技术，可进行抗原或抗体的定量分析。,用放射性同位素、酶、荧光素等标记抗体或抗原等所进行的抗原抗体反应。常用方法有：放射免疫检测技术、免疫荧光技术、酶免疫技术等。特点：敏感度高、特异性强、快速，能进行定性、定量、定位检测,1、常用来标记抗原或抗体的同位素：125I、131I、3H、35S,1）125I，131I的标记氯胺T法：,氯胺T法标记原理：氯胺T是氯代酰胺类氧化剂，在水中不稳定，产生的氯离子将碘离子(I-)氧化为单质碘(I2)，单质碘与抗原或抗体分子上的苯丙氨酸及酪氨酸残基的苯环或组氨酸的咪唑

11、基共价相连，使之发生碘化反应。,125I，131I的标记氯胺T法：,2、标记方法,标记Ag或Ab,标记物纯化,抗原抗体反应,抗原抗体复合物沉淀,测定其放射活性,方法：电泳层析超速离心,聚乙二醇沉淀分离,液相用液体闪烁仪计数，固相用X射线胶片显影,2）3H的标记（N-琥珀酰亚胺2，3-3H丙酸酯）,活泼酯基易和蛋白质的游离氨基反应。,1）直接法：放射活性与抗体浓度呈正比,3、检测方法：直接法和竞争法,2）竞争法：放射活性与待测抗原（未标记）浓度呈反比,标记抗原与非标记抗原和特异抗体结合的能力相同抗原表位之和（标记+非标记的）多于特异性抗体的结合位点（抗原过量，抗体完全反应）。,体外条件下，由非标

12、记抗原（抗体）与定量的标记抗原（抗原）对限量的特异性抗体（抗原）的竞争性抑制的反应。,放射性同位素标记分析法示意图,抗原量一定，标记的抗体和非标记的抗体与抗原竞争结合，放射活性与待测抗体的量成反比,放射活性与抗原量成正比,反应特点：灵敏，精确不稳定安全性差,（二）酶联免疫吸附试验（ELISA）,将待测抗原或抗体吸附于固相表面（聚苯乙烯微量反应板），与酶标记的抗体或抗原反应后，加入底物反应（显色或发光）的分析方法。,1、原理,2、用于标记的酶：碱性磷酸酶（AP）、辣根过氧化物酶（HRP）、脲酶、-半乳糖苷酶等。,不同的酶催化的底物不同，显色产物吸收的波长不同。,有显色反应为正反应；无显色反应为负

13、反应。,被检测的抗原或抗体的量与显色产物的量呈正比。,3、方法,（1）直接法（可检测抗原或抗体）：,酶联免疫吸附试验直接法,（2）间接法（有两种抗体参与，一抗做反应桥梁）,1Ab,2Ab酶,酶联免疫吸附实验间接法,一抗,二抗,（3）夹心法（不同抗体将抗原夹在中间反应）,直接夹心法,间接夹心法,酶联免疫吸附实验夹心法,（三）荧光与发光免疫分析用荧光素（异硫氰酸荧光素、藻红蛋白）或发光化合物标记抗体/抗原，再与吸附于固相表面的抗原/抗体反应，激发抗原抗体复合物发（荧）光，借此对抗原/抗体进行定性或定位。,1、荧光免疫分析,标记物质：荧光素、3价稀土镧系元素铕离子(Eu3+)、铽离子（Tb3+）等。

14、,常用方法：时间分辨荧光免疫分析（TrFIA）借助波长（激发光与荧光波长区别较大）及时间（Eu3+荧光寿命长，待蛋白等发出的非特异荧光消失后再测）控制。,方法分类：直接法间接法直接夹心法间接夹心法,检测：用时间分辨荧光计检测荧光强度。,流程,生物发光：A、标记物质：虫荧素B、发光剂：虫荧酶+ATP+Mg2+O2,2、发光免疫分析（LIR）,1）发光物质,2）方法及原理：同ELISA。,3）测定方法：用瞬时荧光仪测定其发光强度。,（四）亲和标记免疫分析,利用金色葡萄球菌A蛋白与IgG的Fc段的高亲和力，用标记的葡萄球菌A蛋白（替代二抗）与抗体反应的分析方法。,1、标记葡萄球菌A蛋白分析方法,利用

15、被标记物质与检测物质间具有高度亲和力使两者进行特异性结合的分析方法。,实验流程,2、亲和素-生物素复合物分析法,1）亲和素来源：卵蛋白、链霉菌蛋白特点：与生物素有很高的亲和力并进行特异性结合；可用酶、荧光素等标记，标记后不影响其结合能力；,2）生物素（小分子）来源：维生素的一种，多种生物组织，可人工合成特点：与亲和素进行特异性结合；通过双功能连接剂能与抗原、抗体、酶等大分子上的氨基、羧基及糖基共价结合,3）分析方法：,三）抗原抗体反应的其他应用,免疫亲和层析：将一对特异性抗原抗体的组分之一与固相基质交联后来纯化另一组分，常用于蛋白质抗原的分离纯化。,1）方法：,亲和固相的制备：,蛋白质抗原的亲和纯化,纯化方法,批量纯化法柱层析法,A、批量纯化法（可一次纯化多个样品）：将待纯化样品与固相基质混和，待目的蛋白和固相基质结合后，过滤或离心除去未结合的杂蛋白，改变缓冲液条件，洗脱目的蛋白。,B、柱层析法：将亲和固相基质装入柱中，待纯化的样品过柱后，用缓冲液洗涤，再改变PH值或离子强度洗脱特异性蛋白。,洗脱A、方法：改变pHB、原理：pH低于2或高于11时，抗原与抗体便发生解离。C、注意事项：立即用酸或碱调至中性，防止破坏或失活。,免疫亲和层析示意图,思考题,1、名词解释：抗毒素、中和抗体、免疫分析、免疫电泳、免疫标记、抗血