免疫荧光技术的临床应用

1、免疫荧光技术的临床应用天水市第一人民医院检验科李杰，随着人们生活水平和意识的不断提高以及各种因素的影响，近年来，每31人中就有1人患有自身免疫性疾病，其临床表现复杂且难以早期发现。自身免疫性疾病涉及许多学科(风湿病、内分泌学、血液学、妇产科、皮肤病学、肾病学、胃肠病学等)。)。自身免疫性疾病涉及许多疾病(混合结缔组织病、系统性红斑狼疮、磷脂综合征、原发性系统性血管炎、韦格纳肉芽肿、坏死性新月体肾炎、微热病、习惯性流产、干燥综合征、皮肌炎、多发性肌炎、原发性胆汁性肝硬化、原发性胆管炎等)。)。自身免疫性疾病的共同特征：患者血清中有多种自身抗体或免疫反应性淋巴细胞，患者组织器官的病理特征为免疫炎症

2、。相似的疾病模型可以在一些动物实验中用相同的抗原复制，其中大多数抗原具有未知的病因和重叠的疾病，即患者可以同时患有一种以上的自身免疫性疾病，并且病程长，通常是慢性的并且具有遗传倾向。鉴于自身免疫性疾病的共同特点，自身抗体的检测可以有效、准确地诊断自身免疫性疾病，为临床实践提供高效、准确的诊断依据。自身抗体检测的发展不仅大大提高了我院自身免疫性疾病的诊断和治疗水平，也为陇东地区400万人提供了更加准确、专业的诊断服务。节省了患者到其他医院进行检查和诊断的时间和费用，使我院在整个地区具有一定的影响力，同时也给医院带来可观的经济效益。鉴于此，我院应用间接免疫荧光技术检测自身抗体是绝对必要的。根据间接

3、免疫荧光的实验原理，具有明确生化特性的细胞、组织切片或纯化物质可用作检测自身抗体或病原体抗体的抗原基质。如果标本是阳性的，稀释血清中的特异性抗体将与包被在固相上的抗原结合。在第二步中，结合的抗体与荧光素标记的抗人抗体结合，然后在荧光显微镜下观察结果。阳性样品的滴度可在连续稀释后测量。最佳稀释因子是3.162(10的平方根)，因此是10的整数倍(1:10、1:32、1:100、1:320、133601000、1:3200、133601000等。)每隔一步出现一次。每个结合的抗体在相应抗原的位置产生一个典型的荧光模型。基质中的抗原谱完整，可检测多种抗体，检出率高。可以在生物底物上同时检测针对具有不

4、同生化特性的抗原的多种抗体。当酶联免疫试剂所需的抗原难以制备或无法获得时，可选择间接免疫荧光法。间接免疫荧光检测(IFA)是自身抗体检测的标准和最经典的实验方法。需要一台荧光显微镜。操作员需要一定的专业知识。操作员需要一定的工作经验。显微镜下的结果被认为是综合知识的体现。到目前为止，还没有仪器可以代替手动胶片读取。目前，我国自身抗体的测定并不普遍，也不规范，对其意义的研究也很少。自身抗体种类很多，如抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)、类风湿因子和抗CCP抗体，以及自身免疫性肝病相关的自身抗体。临床实验室计划引进自身抗体和相关自身免疫性疾病的检测项目抗核抗体(ANAS)。抗核抗体是一种以核物质为抗

5、原的抗体，可在许多疾病中发现，尤其是结缔组织疾病，常被用作结缔组织疾病的诊断、病情判断和疗效观察的指标(系统性红斑狼疮的筛选抗体)。在非结缔组织疾病(感染、慢性肝、肺纤维化或肿瘤)中也可以是阳性的。正常人(尤其是老年人)也可能呈阳性，但滴度是目前，抗核抗体检测已经成为一项非常重要的自身免疫性疾病临床筛查实验。抗核抗体(ANA)，系统性红斑狼疮活动期95100%非活动期80100%药物性红斑狼疮100%混合性结缔组织病(MCTD，夏普综合征)100%类风湿性关节炎2040%进行性系统性硬化症2050%多发性肌炎和皮肌炎8595%干燥综合征3050%慢性活动性肝炎7080%溃疡性结肠炎3040%其

6、他风湿病26%正常人5-10%，抗核抗体(ANA)，方法间接免疫结果五种常见核型的临床意义不同。ANA有五种常见的核型及其临床意义。核膜类型与抗ds-DNA相关，抗ds-DNA在系统性红斑狼疮中更为常见，尤其是在肾炎患者中，其同质型与美国心脏协会和抗DNA相关。狼疮性肾炎的形成主要与系统性红斑狼疮、药物性红斑狼疮类型和抗ENA有关。还需进一步研究的是，核仁型在硬皮病中更常见，着丝粒型在CREST综合征中更常见，核膜型与抗ds-DNA相关，在系统性红斑狼疮中更常见，尤其是肾炎患者，均质型与AHA(抗组蛋白抗体)和抗DNA相关，LE的形成主要是由系统性红斑狼疮和药物性狼疮引起的，斑点型与抗ENA相

7、关，因此还需进一步研究特异性抗体在硬皮病中更常见。着丝粒型在CREST综合征和ANAs中更常见，包括nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、CENPB、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、核糖体P蛋白、AMAMAMMAM 2等抗nRNP抗体：高滴度抗U1-nRNP抗体是混合结缔组织(MCTD、夏普综合征)的标志，阳性率为95-100%。抗体滴度与疾病活动有关。在30-40%的系统性红斑狼疮患者中也可检测到抗U1-nRNP抗体，但几乎总是伴随有Sm抗体。抗Sm抗体：抗Sm抗体是系统性红斑狼疮的特异性抗体，与抗dsDNA抗体一起作为系统性红斑狼

8、疮的诊断指标，但阳性率仅为5-10%。抗r0-52抗体：当它与其他抗体(如-A)一起出现时，高度提示与-A相关的疾病。抗Scl-70抗体：在25-75%的进行性系统性硬化症(弥漫型)患者中发现，其随实验方法和疾病活动(Scl=硬化症)而变化，但在局限性硬化症患者中未检测到。抗核抗体谱(ANAs)，抗SS-A抗体：它与各种自身免疫性疾病有关，最常见于干燥综合征(40-80%)、系统性红斑狼疮(30-40%)、原发性胆汁性肝硬化(20%)和偶尔的慢性活动性肝炎。在这里，抗SS-A抗体在100%的新生儿红斑狼疮中呈阳性。抗体可通过胎盘传递给胎儿，引起炎症反应和新生儿先天性心脏传导阻滞。抗SS-B抗体

9、：几乎只在患有干燥综合征(40-80%)和系统性红斑狼疮(10-20%)的女性患者中发现，男女比例为1: 29。干燥综合征常同时出现-淀粉样蛋白A抗体和抗-淀粉样蛋白B抗体。抗Jo-1抗体：发现于多发性肌炎，阳性率为25-30%。通常与肺间质纤维化有关。抗着丝粒抗体(CENPB)与局限性进行性系统性硬化症(CREST综合征：钙质沉着症、雷诺病、食管功能障碍、指硬皮病、远端血管扩张)相关，阳性率为70-90%。原发性胆汁性肝硬化患者也可检测到该抗体(阳性率为10-30%)。它也可能出现在雷诺综合征中。抗核抗体谱，抗dsDNA抗体：对系统性红斑狼疮有高度特异性。除抗Sm抗体外，抗dsDNA抗体也可

10、作为该病的血清学标志，阳性率为40-90%，与疾病的活动性有关，可用于监测疗效。抗核小体抗体：系统性红斑狼疮患者血清阳性率为50-95%，特异性接近100%。核小体是钯染色细胞的一个功能亚单位，由DNA和组蛋白以一种特殊的方式组成。在系统性红斑狼疮早期，抗核小体抗体出现早于抗dsDNA抗体和抗组蛋白抗体，在诱发和引起系统性红斑狼疮中起重要作用。组蛋白抗体：一种或几种组蛋白抗体或抗H2A-H2B复合物抗体在药物诱导的红斑狼疮中很常见(95%)。此外，抗组蛋白抗体也可在30-70%的系统性红斑狼疮和15-50%的类风湿性关节炎患者中检测到。抗核糖体P蛋白抗体是系统性红斑狼疮的特异性标志物，阳性率为

11、5-15%。一般认为，ARPA滴度与系统性红斑狼疮活动、中枢神经系统症状和肾脏或肝脏受累有关。抗ds-DNA抗体，临床意义，在系统性红斑狼疮诊断中的高特异性滴度，这与系统性红斑狼疮的活动性有关，可作为疾病监测和疗效观察的指标，并对系统性红斑狼疮肾损害相关的检测方法敏感。间接免疫荧光特异性酶联免疫吸附试验检测高亲和力抗ds-DNA可检测低亲和力抗ds-DNA，有助于监测中枢性红斑狼疮病情。金标免疫斑点法，抗环瓜氨酸肽抗体(抗CCP)，瓜氨酸是类风湿关节炎血清中抗多角蛋白微丝相关抗体的主要抗原决定簇，对类风湿关节炎诊断具有高特异性(98%)。它可用于早期类风湿性关节炎，以预测早期关节炎的发展，早期

12、识别和预测RARA关节的侵蚀和破坏。我科研制的自身免疫性肝炎系列抗体包括：抗肝细胞膜抗体(抗LMA)、抗肝、肾微粒体抗体(抗LKM抗体)、抗肝胰脏抗体(抗脂蛋白抗体)和抗可溶性肝细胞抗体(抗SLA)，是急性肺损伤最特异的诊断指标，阳性率10-30%，特异性100%。RO-52:其他无疾病特异性AIH的诊断指标：1)ana 30-40%；2)ASMA抗平滑肌抗体(F-肌动蛋白)40-90%3)肝细胞膜抗原抗体35%4)去唾液酸糖蛋白受体80-90%PBC其他诊断指标：1)AMA-M455 % 2)AMA-M855 % 3)AMAM 935-85% 4)细胞核30% 0%)重叠综合征(主要发生在自

13、身免疫性肝病中)，(1)类风湿关节炎和类风湿因子早期诊断系列指标，抗RA33/36抗体，抗核因子自身抗体(1)抗核抗体谱ANA，抗ds-DNA，抗ENA抗体(2)抗磷脂抗体(3)抗组织细胞抗体，抗红细胞抗体，抗血小板相关抗体和抗神经元抗体(4)其他射频，p-ANCA，(3)皮肌炎/多发性肌炎，免疫学检查：ANAENA对抗Jo-1呈阳性；其他检查：肌酶谱：心肌和骨骼肌肌酸磷酸激酶(CPK):毫巴-心肌和骨骼肌-乳酸脱氢酶(LDH)，天冬氨酸转氨酶(AST)，丙氨酸转氨酶(ALT)，脑碱性磷酸酶(ALP)；(4)干燥综合征，抗核抗体阳性率40%；ENA抗SSA抗体阳性率70%，75.0%的高球蛋白血症患者白细胞减少。(5)系统性硬化症(pSS)，ANA阳性率50 U%，ENA抗Scl-70阳性率15 %, ACA阳性，(6)混合性结缔组织病(MCTD)，ANA阳性ENA抗RNP高滴度阳性，(7)血管炎，抗中性粒细胞C-ANCA和PR3-ANCA对韦格纳肉芽肿有高度特异性(95%)，其敏感性为80%，与疾病活动