荧光定量PCR简介

1、,荧光定量PCR简介,目录,目录,4,荧光定量PCR原理,1,2,3,定量PCR的实验流程,几种定量方法的比较,StepOne Plus与ViiA7比较及应用,QPCR定量的常见问题,5,什么是PCR,1.1 什么是PCR？,1、荧光定量PCR原理,理想的PCR以2n次方扩增，即： DNAn=DNA02n,QPCR定义,Real time Q-PCR 通过对 PCR 扩增反应中每一次循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。,1.2 QPCR定义,1.3 数学原理,Real time Q-PCR动力学曲线可以分成四个阶段：基线阶段 , 指数增长期、线性增长期和平台期。,基线

2、阈值CT值 DNA0,定量PCR的几个重要的参数：,基线就是扩增曲线的水平部分。,什么是阈值？,基线（空白）信号的产生是由于背景引起的。 默认阈值=基线（背景）信号标准偏差x10,什么是CT值？,荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，一般荧光域值的缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。从基线到指数增长的拐点所对应的循环次数被称为 CT 值（ Threshold Value ）。,PCR扩增的数学模型,扩增产物遵循理论方程： DNAn= DNA0(1+E)n DNAn =扩增产物， DNA0 =起始浓度，E=扩增效率，n=循环数,Ct值与起始浓度的关系,标准曲线,利

3、用已知拷贝数的标准品，按10倍浓度稀释5个成梯度，做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,斜率,Ct=-klg DNA0 +b 斜率=-1/lg(1+e) E=1, 斜率=-3.32 扩增效率范围：90%-110% 斜率范围：-3.1和-3.59之间,1.4 化学原理,常用荧光标记方法： 荧光染料法 -SYBR Green I 特定位点探针法 -TaqMan,化学原理染料法,SYBR Green I 是一种结合于DNA双链小沟的染料。游离时不发光，与DNA结合时发光。每形成一个DNA双链，就有一

4、定数量的染料结合上去。所以荧光信号强度与DNA分子总数目成正比。,1.4.1 染料法化学原理,化学原理探针法,1.4.2 探针法化学原理,TaqMan探针是一种寡核苷酸探针。每产生一条DNA链，就切断一条探针，然后产生一个单位信号，信号强度与结合探针的DNA分子数成正比。,淬灭基团,报告基团,化学原理探针法,1.4.2 探针法化学原理,探针法与染料法的优缺点,1.4.3探针法和染料法的比较,几种定量方法的比较,2、几种定量方法的比较,几种定量方法的比较,Real time Q-PCR在HiSeq2000测序上的优势,1、原理优势：更适合HiSeq2000的桥式PCR。 2、可依据优势：用以上机

5、的样品作为标准品，上机目标更明确。 3、通量优势：目前Caliper Gx 一次完成可完成96个样品，ViiA7一次最多完成180个样品 4、稳定性优势：从cs的clusters分析，QPCR更稳定。,定量PCR的实验流程,3、定量PCR的实验流程,实验操作：,1.稀释标准品 2.稀释样品 3.配制反应预混液 4.加样 5.设置反应程序 6.运行实验 7.分析数据,两种仪器图片,4、StepOne Plus及ViiA7与荧光定量应用,StepOnePlus System,Life Tech-ViiA7,VS,两种仪器比较,4.1 StepOne Plus及ViiA7对比,荧光定量的应用,4.2 荧光定量的应用,1、DNA或RNA的定量分析。包括病原微生物或病毒含量的检测，转基因动植物转基因拷贝数的检测等。 2、基因表达差异分析。例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异（如药物处理、物理处理、化学处理等），特定基因在不同时期的表达差异以及cDNA芯片的确认。 3、其它。例如SNP检测，性别鉴定等。,曲线成弯曲的原因,5、QPCR定量的常见问题,5.1 扩增曲线弯曲,原因：样品浓度跨度太大，有的样品浓度太高，在同一基线设置情况下，会导致Ct值太小（小于基线右侧）的样品的曲线在右侧下跌。 解决方案：对于能检测出Ct的样品，读出数据；浓度太高的样品，需稀