凝胶阻滞-EMSA.ppt

1、凝 胶 阻 滞Electro Mobility Shift Assay，EMSAGel Shift Assay,YTH,凝胶迁移实验（gel-shift experiment）是在80年代初期出现的用于在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术，它具有简单、快捷等特点，也是当前被选作检测特定DNA结合蛋白质的一种典型的方法。目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用,实验原理,在Gel-shift experiment实验中，首先是用32P标记待测的DNA片段（probe），然后同细胞蛋白质提取物一起温育，于是使有可能形成DNA-蛋白质复合物。将它加样到非变性的PA

2、GE中，在控制使蛋白质仍与DNA保持结合状态的条件下进行电泳分离，并运用放射自显影技术显现具放射性标记的DNA条带位置。如果细胞蛋白提取物中不存在可与32P标记的探针DNA结合的蛋白质，那么所有的32P都将集中在凝胶底部；反之，将会形成DNA-蛋白质复合物，由于凝胶阻滞的原因，其特有的32P标记的探针DNA条带都将滞后出现在较靠近凝胶顶部的位置。,EMSA: Principle,R. Voll 09/01,A double-stranded oligonucleotide containig a NF-B- binding site is labeled with a radioactive

3、isotope and incubated with a nuclear extract. During gel-electrophoresis, NF-B bound to the oligonucleotide causes a shift compared to the free probe.,NF-B,Free Probe,Radioaktively labeled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe) and bound NF-B,Radioactively labeled oligonucleotide with NF-B

4、 - binding site (probe),Nuclear extract of non-activated cells,Nuclear extract of activated cells,Gel-shift实验还可以用来研究发生上述结合作用的DNA序列的精确特异性，其方法是在DNA-蛋白质结合反应体系中，加入超量的非标记竞争DNA（competitor DNA）。如果它与同位素标记的DNA结合是同一种蛋白，那么由于竞争DNA是极大量的，绝大部分蛋白质将被其竞争结合掉而使探针DNA仍处于自由状态，所以就不会出现阻滞的条带；相反，如果反应中加入的竞争DNA并不能够同探针DNA竞争结合同一蛋

5、白质，于是探针DNA便仍然与特定的蛋白质结合形成复合物，结果在放射自显影图谱上就会呈现阻滞的条带。同样，在竞争DNA上已知的转录因子结合位点，事先引入一个或数个碱基突变，通过凝胶阻滞实验也可有效地评估这些突变对竞争DNA的功能及其与转录因子结合作用的影响。,R. Voll 09/01,Supershift,A double-stranded oligonucleotide containig a NF-B- binding site is labelled radioactive and incubated with a nuclear extract. During gel-electrop

6、horesis, NF-B bound to the oligonucleotide causes a shift compared to the free probe.,p50/p65,Free probe,Radioaktiv labelled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe) and bound NF-B,Radioactiv labelled oligonucleotide with NF-B - binding site (probe),Nuclear extract of activated cells,Nuclear

7、 extract of activated cells with anti-p50 antibody,p50/p65 + anti-p50,R. Voll 09/01,Competition with Unlabeled Oligos,Increasing amounts of unlabeled oligos containing the NF-kB binding site or unlabeled oligos with a mutated binding site were added to the reaction mix prior to gel electrophoresis.

8、Specific binding is extinguished only by the non-mutated oligo.,p50/p50,Free probe,p50/p65,Unspecific,Wild type oligo Mutated oligo,GGG GAC TTT CCC,GGA GAC TTT CCC,1、实验前准备2、形成蛋白-探针复合物 3、制备凝胶，电泳 4、转膜 5、检测,实验操作步骤,1、实验前准备（1）合理的实验方案根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等。（2）样本制备可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。（3）探针制备,注意事项,2、检测（1）去除转好的膜，放入合适的盛有缓冲液的容器中，冲洗,注意整个检测过程避免膜干燥。（2）去掉冲洗缓冲液，加入封闭液后轻微震荡，室温封闭20min。（3）加入适量的HRP酶标记的链霉亲和素（Streptavidin-HRP conjugate），室温震荡孵育45min。（勿将酶标记物直接加到膜上）（4）去掉酶联物