第十一章 HPLC-1.pptx

1、高效液相色谱法,High Performance Liauid Chromutography (HPLC),第一节 绪论,HPLC使用了高效微粒多孔固定相，装填在小口径、短不锈钢柱内，流动相通过高压输液泵进入高柱压的色谱柱，实现在短的分析时间内获得高柱效和高选择性的分离能力。,LC HPLC 柱径 1 5cm 2 10mm 颗粒 75 600m 5 50 m 压力 常压 高压 tR 1 20h 1h内 n 2 50 105 / 米 用途 初步分离 高效分离、高灵敏度定量 装置 非仪器化 精密仪器，自动化, 智能化,HPLC与经典液相（柱）色谱法的比较,HPLC 优点： 柱效高 分析时间短 可定

2、量 定性,适于高沸点不易挥发的、受热不稳定易分解的、相对分子质量大、不同极性的有机化合物；生物活性物质和天然产物、合成的和天然的高分子化合物。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多(80%)是通过HPLC来完成的。,三、 HPLC 的应用范围,各种HPLC方法的应用范围及对象,第二节 高效液相色谱仪简介,高效液相色谱仪的结构一般可分为4个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。,1、贮液罐和过滤器：,一、 高压输液系统,贮液罐: 0.5-2L的玻璃瓶，放置位置要

3、高于泵体，使用过程中应密封。,流动相的过滤器: 0.45 m 滤膜过滤，常使用G4微孔玻璃漏斗。 吸滤器：0.45 m多孔不锈钢过滤器。滤芯孔径约23 m。,离线脱气：抽真空脱气、超声、吹氦 在线真空脱气装置,2、脱气装置 ：,将相对分子量小的气体从溶剂中除去,3、高压输液泵：恒流泵、恒压泵,要求,流量准确可调、可调范围宽：填充柱分析型为0.1-10mL/min，制备柱为1-100mL/min。 耐高压：输出压力常达30-60MPa 液流稳定。 结构材料应耐化学腐蚀,单柱塞往复式恒流泵,脉动较大,双活塞型往复泵,4、梯度洗脱装置：,高压梯度： 用于二元梯度，用两个泵分别按设定的比例输送A和B两

4、溶液至混合器。,低压梯度： 只用一个高压泵，在泵前安装了一个比例阀，混合就在比例阀中完成。,二、 进样系统,常用手动进样器六通阀进样器,Load,Inject,使用定量环的定量：六通阀进样器的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。 使用部分装液法进样时，进样量最多为定量环体积的75%，如20L的定量环最多进样15L的样品，并且要求每次进样体积准确、相同； 使用完全装液法进样时，进样量最少为定量环体积的3至5倍，即20L的定量环最少进样60至100L的样品，这样才能完全置换样品定量环内残留的溶液，达到所要求的精密度及重现性。,自动进样器,色谱柱是高效液相色谱的心脏，在HPLC的使用中， 保持色谱

5、柱的柱效，延长柱子的使用寿命非常重要。,三、色谱柱,色谱柱流速方向,色谱柱的参数,色谱柱 结构：柱管多用不锈钢制成，色谱柱两端的柱接头内装有 筛板，目的是防止填料漏出。 填料： 粒度多为0.220 m(以510m居多) 。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 规格：常规分析柱(常量柱) 内径25mm(常用4.6mm， 3.9mm)，柱长1030cm (15cm，25cm居多）,预柱和保护柱,从泵来的流动相,预柱,进样口,保护柱,分析柱,检 测 器,预柱是针对流动相来保护色谱柱 保护柱是针对样品来保护色谱柱,precolumn预柱，guard column保护柱 安装位置不同：预柱是泵后进

6、样口前，途经流动相；保护柱是进样口后分析柱前，途经样品和流动相。作用不同：预柱则只能起到过滤颗粒物作用，防止颗粒物堵塞色谱柱筛板引起柱压升高。保护柱除了可以过滤颗粒物外，因为带1厘米长的填料，强保留物质就先留在保护柱的柱芯填料里面，这样可以避免色谱柱被强保留物质污染。,四、 检测系统,第三节 HPLC的固定相和流动相,一、固定相,（一）吸附色谱固定相：,2. 全多孔微粒型（使用广泛） 如2-10 m全多孔球形微粒硅胶，其比表面积为200-500 m2/g，平均孔径5-100 nm。 此类固定相由于颗粒很细，孔仍然较浅，传质速度快，特别适合复杂混合物的分离及痕量分析。,1. 表面多孔型（薄壳型

7、） 颗粒直径3 0m，涂层1 2 m 硅胶、氧化铝等,实心玻璃微球,3,1 2 m,流动相的浅孔,特点：多孔层厚度小，孔浅，相对死 体积小，传质速度快，分析速 度快 柱容量低,（二）液液分配色谱法固定相化学键合相 化学键合相，用化学键把固定液键合到载体表面的官能团上，非常稳定，在使用中不易流失。根据制备方法分为： 1. 硅酸酯键合固定相,特点：易水解、醇解 热稳定性差 只适用不含水或醇的流动相,2.,或,共价键键合固定相,特点：不易水解，热稳定性较硅酸酯好。 当使用水溶液时，严格限制pH在4-8范围内。,特点：性质稳定、不易吸水、耐有机溶剂，70以下，pH28范围内使用。,3. 硅烷化型,二、

8、流动相,选择流动相时应注意的几个问题 液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点：,流动相对样品具有一定的溶解能力， 保证样品组分不会沉淀在柱中 ( 或长时间保留在柱中 ) 。 流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 ( 特殊情况除外，如配位色谱等 ) 流动相的黏度要尽量小，以便降低柱压，延长色谱柱 使用的寿命 避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。 如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。,流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用 UV 检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，

9、导致实验无法 正常进行。 在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相 中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量 氧与样品发生作用。 尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,溶剂强度参数：表示溶剂对化合物洗脱能力的一种指标。定义是溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能，表征溶剂分子对吸附剂的亲和程度。越大表示洗脱能力越强。 溶解度参数：表示1mol理想气体冷却转变成液体时释放的凝聚能与液体摩尔体积比值的平方根。对非极性化合物，其聚合能很小，因此溶解度参数小，极性化合物则大。因此，溶解度参数可在液液分配色谱中作为衡量溶剂极性强度的指标。 极

10、性参数：表示每种溶剂与乙醇、对二氧六环和硝基甲烷三种极性物质相互作用的量度。反映了每种溶剂洗脱强度的大小。 三者以相同的趋向增大或减小，通常仅选择一种参数表示溶剂的极性大小。,2. 溶剂的特性参数,常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯 四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小) 3. 混合溶剂 4.溶剂的选择性分组 在溶剂选择性分组的三角形坐标图中（p359），常用的溶剂可分为8个选择性不同的特征组，处于同一组中的溶剂具有相似的极性。,正相柱：固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团，

11、如胺基(NH2)和 氰基(CN)的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH)或其他极性基 团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即 极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱；正相色谱使用的流动相极性相 对比固定相低，如正已烷、氯仿 、二氯甲烷等。反相柱：固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的 键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲 醇，乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先 被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向 填料有:C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等

12、。,正相柱和反相柱,第四节 常规样品反相分离的系统方法,对于大多数常规样品（分子量小于1000），包括中性和离子化合物，用反相条件建立方法几乎以相同方式进行。,一、指导原则 推荐的常规样品的反相色谱法的建立方案基于以下考虑： （1）改变可明显改善选择性的条件 （2）避免会影响方法普适性的实际问题 （3）减少必要的实验次数 （4）先不做不易进行的实验（如色谱柱，pH值，使用复杂的混合溶剂等） 基于以上几点考虑，提出对一套简单有效的建立方法方案。,1、样品分类,常规样品 可通过改变溶剂浓度和类型（或柱温）找到合适的分离条件。 特殊样品 无机离子 对映体 生物分子 合成的高分子 异构体,2、初始分离

13、条件,3、确保准确的保留数据,要求在采集有效的保留数据前色谱柱达到完全平衡。 当色谱柱流动相或温度发生变化时，进样前都要求用10倍柱体积的新流动相来平衡。 操作： （1）用至少10倍于柱体积的新流动相清洗色谱柱 （2）进样 （3）用至少5倍于柱体积的流动相清洗色谱柱 （4）进样 直至得到稳定的保留值（0.02 min）,4、确保好的柱性能,第一步或第二步试验运行完成，更重要的是考察色谱图的峰形和塔板数。 对15 cm，5 m的色谱柱，流速为2ml/min时，不对称因子应在0.9-1.5之间，分子量小于1000 Da的样品，等度洗脱的塔板数应4000。在梯度运行情况下，半峰宽应小于0.4 min。,二、实验开始,初始实验条件的