紫外可见分光光度法在食品检测中的应用

1、第二章紫外可见分光光度法在食品检验中的应用、一、紫外可见分光光度法的概要、一、紫外可见分光光度法是什么？ 基于物质分子对波长在200-760nm范围的电磁波的吸收特性建立的定性定量结构分析方法。2、什么是吸收曲线(吸收光谱)？ 记述物质分子的放射线吸收程度根据波长变化的函数关系曲线。 具体方法：使不同波长的光通过被测定物，被测定物吸收后，测定对不同波长的光的吸收程度(吸光度a )，将吸光度a画在纵轴，放射波长画在横轴上，得到该物质的吸收光谱或吸收曲线。 吸收光谱的产生：运动分子外侧的电子吸收外来辐射产生电子能级过渡分子的吸收光谱，3、吸收曲线决定物质定性定量的基础和方法(1)定性基础：吸收曲线

2、上的max、min、肩峰和吸收光谱整体形状取决于物质的性质，其特征取决于物质结构为什么不同的物质在特定波长产生吸收峰值？ 由于不同物质的结构不同，或者其分子能级的能量(各种能级能量的总和)和能量间隔不同，因此不同物质选择性地吸收不同波长和能量的外来辐射，是UV-Vis定性分析的基础。 (P164-166:电子迁移的种类)，(2)定性分析方法：与标准品、标准光谱图比较吸收光谱的特征数据，与吸收率的比， (3)紫外可见光谱定性分析的极限有机化合物的紫外吸收光谱反映了结构中生色团和助色团的特性，不完全反映分子特性：紫外吸收光谱只有23个宽的吸收峰，同一生色团具有不同的分子结构，在大的分子中影响生色团

3、的紫外吸收峰不同的分子结构可能产生相同的紫外吸收光谱，两个化合物不一定相同。 例如，甲苯和乙苯：光谱图基本相同，(4)紫外光谱用于有机化合物的结构辅助分析，a .得到的结构信息1)200800nm没有吸收峰。 脂肪族烃、胺、醇、卤化烃等不含双键和环状共轭系，没有醛、酮、溴、碘等基。 2) 270350 nm处有弱的吸收峰(=10100 )，其他的强的吸收峰没有的情况是，仅产生具有非共轭的n电子的显色团的n*迁移(r波段)3) 250300 nm处有中强度的吸收峰(=2002000 )，芳香环的特征吸收(4) 210350 nm处有强吸收峰(104 )，显示了包含两个双键的共轭系(k )带。 共

4、轭二烯： k波段(230 nm )、-不饱和醛固酮： k波段230 nm、260nm350 nm处具有强吸收峰35个双键的共轭系。 b .光谱分析的注意事项1 )确认max，计算log，初步估计属于哪个吸收带2 )观察主要的吸收带的范围，判断属于哪个共轭系3 )在ph的影响下添加NaOH红位移酚系化合物、烯醇。 加入HCl蓝移位苯胺系化合物。 4 )识别可能存在于未知分子中的生色团、助色团，估计共轭度。 (5)定量基础：朗伯-比尔定律和吸光度的和性朗伯-比尔定律：光强度I0的单色光通过浓度c、厚度l的溶液时，溶液对光的吸收率与溶液浓度和液体层的厚度成比例，式为A=KLc， (6)朗伯-比尔定律

5、应注意的几个问题： k是吸收系数、单色光的波长、浓度、溶剂、温度一定时，k是常数，k是常用摩尔吸收系数所表示的朗伯-比尔定律仅适用于单色光、溶液，仪器分光系统和测定液的状态对定量正确性有影响.(7) 根据朗伯-比尔定律，在相同条件下测量，A-c曲线必须是通过原点的直线，但在实际工作中经常会出现直线弯曲，被称为朗伯-比尔定律的偏差。 原因：由于吸收物质浓度高的非单色光导致介质不均匀，导致光吸收物质不稳定。、摩尔吸收系数：1mol/L浓度的溶液、液层厚为1cm时的吸收率。 强吸收： 104； 中强度吸收： 102 104； 弱吸收： 102； 摩尔吸收系数不能直接测定吗？ (8)吸光度的加算性：在

6、多成分共存的溶液体系中，体系的总吸收率等于各成分的吸收率之和，在任意波长共存的多成分的各成分遵循朗伯-维尔定律。 这是多成分定量的基础。 a总=A1 A2 Ai=1bc 2bc ibc，(9)定量分析方法：a，一液定量方法1 )标准曲线法首先在全频带扫描中，根据吸收曲线的特征选择入射波长，调制该物质不同浓度的标准溶液，测定入射波长下的吸光值，得到标准曲线后，通过标准曲线法测定的样品的浓度(2)标准比较法：标准曲线法的简化，即，仅调制一个浓度cs的标准溶液，测定其吸光度，求出吸收系数k，由Ax=kcx求出cx的方法，在测定浓度范围内遵守L-B的法则，并且仅在cx几乎相当于cs的情况下，才能得到正

7、确的结果。b .多成分定量法因为吸光度有加性，所以可以在同一样品中测定多个成分。 假设样品有x和y两组，使其发色后，分别描绘吸收曲线，就会出现如图所示的三种情况。、例如1.0010-3molL-1的K2Cr2O7溶液和1.0010-4 molL-1的KMnO4溶液在450nm波长下的吸光度分别为0.200和0，530 nm波长下的吸光度分别为0.050和0.420。 现在，两者的混合溶液在450nm和530nm的波长下的吸光度被测定为0.380和0.710。 计算了该混合溶液中的K2Cr2O7和KMnO4的浓度。 (吸收池的厚度为10.0mm )。c .4，紫外可见分光光度计的构成，类型和使用

8、，(1)构成：光源，单色器，吸收池，检测器，信号处理器，显示器可视光源：碘钨丝灯，钨丝灯： 320-2500nm紫外光源：氢灯，重氢灯，水银灯玻璃吸收池：仅可见光区域石英池：可以用于紫外光区域和可见光区域，玻璃吸收池和石英池能吸收一对识别池吗？ (2)紫外可见分光光度计的类型和使用：1.单光束分光光度计：不能自动扫描可定量分析的吸收曲线。 752型紫外可见分光光度计，a )电源接通预热b )波长设定c )测试模式d )零e )测量样品，读取值，2 )双光束分光光度计：可以进行减少误差的波长扫描，描绘吸收曲线。TU-1901紫外可见分光光度计，a )打开电源打开开关，打开样品室，预热10min

9、b )软件c )打开测试模式，波长d )空白液零e )测试样品，双波长分光光度计：用刀具交替地将两种波长的光放入吸收池(a )可以测定多成分样品、混浊样品的b )不需要参照液(由于参照池的差异和空白溶液的调制等引起的误差消失) c )通过波长的选择容易地修正背景吸收，消除吸收光谱重叠的干扰d )克服电源不稳定引起的误差，灵敏度高。 2950型、4 ) .多通道分光光度计可进行分光扫描、光度测定、定量测定、时间扫描，光源，透镜，吸收池，光栅，光电二极管阵列检测器，TU-1800SPC紫外可见分光光度计，5 )新型分光光度计光度计PhotoLab Spektral，多种形状吸收池，DR2700型便

10、携式分光光度计，便携性，5， (1)根据检测波长的选择吸收曲线选择其他物质难以干涉的高、宽的吸收峰的波长；(2)溶剂的选择和处理方法的选择原则：在能够完全溶解样品的波长范围内，透光性高、纯度为“光谱纯”处理方法：将蒸馏水煮沸去除气泡乙醇包括醛类、去除苯等杂质的环己烷、正己烷去除苯； 氯仿可以防止光和空气的破坏，醚可以去除过氧化物； 溶剂参考：样品组成简单，共存成分少(基质干涉少)，显色剂不吸收的情况下，请直接参考溶剂(蒸馏水多)2)试剂的比较：显色剂或其他试剂在测定波长下吸收的情况下，以试剂为比较对象(不添加测定对象物)。 3 )样品参考：在测定波长下不吸收显色剂，样品基质吸收，样品基质不与显

11、色剂反应的情况下，可以参考样品(不能添加显色剂) . (4)改变被检液浓度以使吸光度测定范围的选择吸光度在0.160.80的范围内的(5)显色反应条件的选择显色剂使用量溶液的酸性度、温度、显色时间干扰组成的去除、二、紫外可见分光光度法在食品检查中的应用、(一)、食品酶分析一般步骤：粗酶液调制反应结束反应(显色) 测定注意事项：粗酶液制备时根据目标酶的性质选择缓冲液、温度、时间等条件的酶和底物的反应条件也必须适当，一般检测产物的变化量多。二、紫外可见分光光度法在食品检测中的应用，(一)、食品酶分析1、-半乳糖苷酶(乳糖酶)以onpg (邻硝基苯-D-半乳糖苷酶)为基质测定-半乳糖苷酶活性。 邻硝

12、基酚(ONP ) :黄色，420nm有特异性吸收，不同豆类乳糖酶活性的研究样品处理：红豆、绿豆、花生、大豆萌发20mL预冷缓冲液A(0.1mol/L磷酸缓冲液，ph7. 0，5 %甘油和1 mmol/反应：将5mmol/Lonpg0.2ml、ph4.0的0.1mol/L NaAc-HAc缓冲液0.1mL和稀释为25倍的各种粗酶液0.1mL在50水浴中正确地反应15分钟后，加入0.2mol/l碳酸钠溶液0.1mL中止反应。 测定：用紫外分光光度计420nm测定反应液的吸光度。 计算：根据发生的ONP的量计算酶活性。 酶活性单元被定义为在规定的条件下，在每分钟420nm的波长下使吸光度单元每次增加

13、0.001个所需的酶量。 用，2，蛋白酶活性测定中性蛋白酶，酸性蛋白酶，碱性蛋白酶调制粗酶液时所使用的缓冲液的pH值为，林-酚法，林-酚法，原理：林-酚试剂(林环因为蛋白质含有具有酚基的氨基酸(酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸)，蛋白质及其水解物也发生反应。 用蛋白酶分解酪蛋白(基质)生成含酚基氨基酸的显色反应，间接测定蛋白酶的活力。 操作过程：将酶和底物(酪蛋白)在一定条件下反应一定时间后，中止反应，取一定量的反应液和多酚试剂，发生显色反应，最后用分光光度法测定生成的显色物质的量。GB/T23527-2009 :蛋白酶活性测定，所需仪器和设备分析天平：精度0.0001g恒温水浴：精度0.2小时计分光

14、光度计沸水器振动混合器pH计：精度0.01pH单位试剂和溶液乳酸缓冲液(pH=3.0 )适合酸性蛋白酶磷酸缓冲液的制备(ph=7) 适用于中性蛋白酶硼酸缓冲液(pH=10.5 )碱性蛋白酶0.4mol/L碳酸钠溶液0.4mol/L的三氯乙酸液的10.00mg/ml酪蛋白溶液100g/ml酪氨酸标准溶液林酚试剂，粗测定中性蛋白酶时，将pH7.5的磷酸盐缓冲液50 mL浸渍在25中1h，测定酸性蛋白酶时，将pH 3. 0的乳酸钠缓冲液50 mL浸渍在25中1h，测定碱性蛋白酶时，将pH10.5的硼砂氢氧化钠缓冲液50 mL浸渍在25中，进行浸渍标准曲线L-酪氨酸标准溶液如下表所示调制。 分别采集上

15、述溶液各1.00ml (需要平行试验)，分别加入0.4mol/L的碳酸钠溶液5.00ml。 森林试剂使用1.00ml溶液，在40 0.2水浴中显色20min，用分光光度计取出波长680nm的比色，以不含酪氨酸的0管为空白管零点，分别测定吸光度值，以吸光度值为纵轴，以酪氨酸浓度为横轴，制作标准曲线或计算回归方程式。 样品测定：首先将酪蛋白溶液放入(400.2 )恒温水浴中，用预热5min取4根试管，各加入1ml酶液，制成空白管，加入2ml三氯乙酸，其他3根管中各加入1ml奶酪，摇动，保温40分钟进行试验静置10min，过滤沉淀物，各采集1ml滤液，分别加入Na2CO3 5ml、林试剂1 ml 0

16、.4 mol/l。 40显色20min。 在680nm处测量OD值。 用空白管对准零点。 注：1.398中性蛋白酶制剂和166中性蛋白酸制剂除了反应和发色温度为300.2外，其他操作相同，标准曲线进行了相同的处理。 计算：酶活性定义为40，在一定的pH条件下，酪蛋白水解1 min，产生1g酪氨酸的酶量定义为蛋白酶活性单位，酶活性单位定义为ug/min。 样品酶活性的计算： X(U/g)=C74V/(10m )其中，c是根据测定样品时的吸光度由标准曲线得到的酪氨酸的浓度(ug/mL ) . 4是酶分解反应时反应体系体积相对于酶溶液体积的稀释倍数，10是酶分解反应的时间(min )。“用紫外光谱法定量测定不同蛋白酶活性的研究”的原理：用蛋白酶在一定温度和pH条件下水解酪蛋白基质，用水浴60分解酶后，加入三氯乙酸沉淀除去未水解酪蛋白，滤液吸收紫外光，用紫外光谱法测定。 由吸光度计算蛋白酶活性。 试剂：2%酪蛋白溶液； 标准酪氨酸溶液100 g/ml； 0. 4 mol/L三氯乙酸溶液； 缓冲溶液，操作步骤：粗酶液调制同上法。 测定波长的选择：在230 500 nm范围内扫描，得到其吸收光谱曲线。操作步骤