微生物的实验室培养

1、,微生物的培养 培养基,衣藻？ 大肠杆菌？ 硝化细菌？,注意：微生物根据代谢类型进行分类,微生物的营养,营养物(Nutrient)：凡能够满足机体生长、繁殖和完成种种生理活动所需要的物质通常称为微生物的营养物。 营养物质是微生物新陈代谢和一切生命活动的物质基础，失去这个基础，生命也就停止。,回忆有关活细胞中元素组成的知识，想一想培养基中应该含有哪类物质？,C、H、O、N、P、S在不同微生物体内含量（占细胞的质量分数）,按照它们在机体中的生理作用不同，可以将营养物质分成六大类。 1. 碳源 2. 氮源 3. 无机盐 4. 水分 5.生长因子 6.能源,碳源,一切能满足微生物生长繁殖所需要C元素、

2、能源物质的营养物称为碳源。,实验室配制微生物培养基常用碳源： 葡萄糖、 蔗糖、可溶性淀粉,工业生产常用的碳源 ： 淀粉、糖、麸皮、米糠等,异养微生物,自养微生物,功能：提供碳元素、能源，构成细胞成分，形成代谢产物,氮源,凡提供微生物生长繁殖所需要氮元素的营养源，称为氮源。,实验室配制微生物培养基常用氮源 蛋白胨、牛肉浸膏、酵母浸膏、尿素、铵盐、硝酸盐,工业生产常用的氮源 尿素、玉米浆、鱼粉、蚕蛹、黄豆饼、花生饼等,功能：为微生物提供氮元素、合成蛋白质、核酸、 含氮代谢产物,水,功能 1.是微生物细胞的重要组成部分，使原生质保持溶胶状态，物质溶剂和运输介质的作用，保证代谢正常进行 2. 是物质代

3、谢的原料 3. 有效控制细胞内的温度变化,无机盐,包括P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe；Cu、Zn、Mn、Mo、Co、B等，主要以离子的形式存在,另外还需要满足微生物生长对特殊营养物质的要求. 通常指那些微生物生长所必需而且需要量很小，但微生物自身不能合成或合成量不足以满足机体生长需要的有机化合物。 例如： 维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶),功能：酶和核酸的组成成分，微生物生长不可缺少的微量有机物.,生长因子,几种微生物所需的生长因子,种类：维生素、氨基酸、碱基,PH 微生物种类 最适PH 放线菌 7.58.5 细菌 6.57.5 真菌 5.06.0,为了维持培养基pH的相对恒定通常在培养基

4、中加入pH缓冲剂或在进行工业发酵时补加酸、碱,满足对pH、氧气、二氧化碳、渗透压等物理化学条件适宜的要求。,配制原则：提供微生物生长繁殖所需的一切营养物质；符合微生物的营养特点；使各种营养物质的比例和浓度合适、pH适宜,例：有关微生物营养物质的叙述中，正确的是 A.是碳源的物质不可能同时是氮源 B.凡碳源都提供能量 C.除水以外的无机物只提供无机盐 D.无机氮源也能提供能量,如CO2，NaHCO3,如CO2只能是碳源；如NH4HCO3可同时是氮源 ；如葡萄糖同时是能源；如蛋白胨同时是氮源，也是能源，。,如NH3可为硝化细菌提供能量和氮源。,微生物培养基（培养液）的种类,人们按照微生物对营养物的

5、不同需求， 由人工方法配制出供微生物生长繁殖的营养基质。,培养基种类繁多，根据其成分、物理状态和用途可将培养分成多种类型。,培养基的类型及应用,按成分不同划分,天然培养基,合成培养基,含用化学成分还不清楚或化学成分不恒定的天然有机物,牛肉膏蛋白胨培养基、麦芽汁培养基,化学成分完全了解的物质配制而成的培养基,高氏1号培养基、查氏培养基,天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：来源受限;成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析;易发生支原体污染;,天然培养基：,根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。 合成培养基主

6、要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点：标准化生产，组分和含量相对固定；成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,合成培养基:,血清中含有： 多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） 多种金属离子； 激素； 促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。 各种生长因子 转移蛋白 不明成分,人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。,按物理状态不同划分,固体培养基,液体培养基,琼脂含量一般为1.5%-2.0%,琼脂含量一般为0.2%-0.7%,不加任何凝固剂,半固体培养基,固体培养基常用来进行微生物的

7、分离、鉴定、活菌计数及菌种保藏,观察微生物的运动特征、分类鉴定、贮藏,大规模工业生产及在实验室进行微生物的基础理论和应用方面的研究,凝固剂琼脂,（从红藻中提取的多糖，98度以上熔化，44度以下凝固）,按用途不同划分,鉴别培养基,用来将某种或某类微生物从混杂的微生物群体中分离出来的培养基,用于鉴别不同类型微生物的培养基,选择培养基,微生物产生某种代谢产物，与培养基中的特殊化学物质发生特定的化学反应，产生明显的特征变化,在培养基中加入/不加相应的特殊营养物质或化学物质，抑制不需要的微生物的生长，有利于所需微生物的生长,基础培养基,含有一般微生物生长繁殖所需的基本营养物质的培养基,牛肉膏蛋白胨培养基

8、是最常用的基础培养基, 选择培养基,加入链霉素/青霉素等抗生素的培养基： 分离酵母菌、霉菌等真菌 筛选导入了重组质粒的受体细胞 加入高浓度食盐的培养基： 分离金黄色葡萄球菌,加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的HAT培养基: 分离杂交瘤细胞,不加氮源的无氮培养基： 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基： 分离自养型微生物,鉴别培养基,加某种试剂或化学物质，鉴别不同种类的微生物。,伊红美蓝培养基可鉴别大肠杆菌和产气肠杆菌：大肠杆菌菌落小,有绿色金属光泽。产气肠杆菌落大,湿润,呈现灰棕色。,2.不同的微生物往往需要采用不同的培养基配方 (参考教材附录内容),3.不管哪种培养基，一般都含有水、碳

9、源、和氮源、 无机盐、等营养物质，另外还需要满足微生物生长对pH、特殊营养物质等的要求。 例如: 生长因子(即细菌生长必需，而自身不能合成的化合物,如维生素、某些氨基酸、嘌呤、嘧啶)以及氧气、二氧化碳、渗透压等的要求。,常见的培养四大类微生物的培养基（以1000ml为例）,细菌（牛肉膏蛋白胨培养基）： 牛肉膏 蛋白胨 NaCl H2O 3g 10g 5g 1000ml,放线菌（高氏1号） 淀粉 K2HPO4 NaCl MgSO4.7H2O KNO3 FeSO4 H2O 20g 0.5g 0.5g 0.5g 1g 0.01g 1000ml,酵母菌(麦芽汁培养基) 干麦芽粉加四倍水，在50-60保

10、温糖化3-4小时，用碘液试验检查至糖化完全为止，调整糖液浓度为10。煮沸后，纱布过滤，调PH为6.0。,霉菌（查氏合成培养基） NaNO3 K2HPO4 KCl MgSO4.7H2O FeSO4 蔗糖 H2O 3g 1g 0.5g 0.5g 0.01g 30g 1000ml,培养基的,1.配制培养液（计算-称量-溶化） 2.调pH值 3.分装、包扎：试管高度的1/5，注意不要污染棉塞。（漏斗）（注明何种培养基） 4.灭菌：培养基灭菌后必须在370C下恒温培养24h，确定无菌生长，方可使用。 5.搁置斜面: 约为试管长的1/2 倒平板：,配制方法和步骤,培养基配制的基本原则：,目的明确,营养协调

11、,理化条件适宜,经济节约,（二）无菌技术,无菌操作泛指在培养微生物的操作中，所有防止杂菌污染的方法。,灭菌与消毒技术是微生物有关工作中最普通也是最重要的技术。,灭菌：,以化学剂或物理方法消灭所有微生物，包括所有细菌的繁殖体、芽孢、霉菌及病毒，而达到完全无菌之过程。,(2)方法：,高压蒸气灭菌： 100kPa、121 下维持15-30min.,最常用的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，它可以杀灭所有的生物，包括最耐热的某些微生物的休眠体，同时可以基本保持培养基的营养成分不被破坏。,干热灭菌： 160-170 下加热1-2h。,玻璃器皿可采用高温干热灭菌。为了防止杂菌，特别是空气中的杂菌污染，试管及玻璃烧瓶

12、都需采用适宜的塞子塞口，通常采用棉花塞，也可采用各种金属、塑料及硅胶帽，它们只可让空气通过，而空气中的其他微生物不能通过。 而平皿是由正反两平面板互扣而成，这种器具是专为防止空气中微生物的污染而设计的。,灼烧灭菌,消毒定义： 利用化学或物理方法，杀死大部份致病微生物的过程。,消毒,区分为高程度消毒、中程度消毒、低程度消毒三种方式。,1、煮沸消毒法:100煮沸5-6min 2、巴氏消毒法：70-75 下煮30min或 80 下煮15min 3、化学药剂消毒法:用75%酒精、新洁尔灭等进行皮肤消毒;氯气消毒水源 4、紫外线消毒 ,常用的消毒方法,无菌技术,消毒：采用较温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部一部分对人体或动、植物有害的病原菌。而对被消毒的对象基本无害的措施。,灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的措施。,3.微生物实验室培养的基本操作程序,1、器具的灭菌 2、培养基的配制 3、培养基的灭菌 4、倒平板 5、微生物接