分子发光光谱法

1、第五章是分子发光光谱。当某些物质的分子吸收一定量的能量后，电子从基态跃迁到激发态，并以光辐射的形式从激发态返回到基态。这种现象称为分子发光，在此基础上建立的分析方法是分子发光分析。分子在去激发过程中以光辐射的形式释放能量，5.1概述，1。分子发光分析及其分类，根据分子受激发时吸收的能量和辐射光的机理，可分为以下几类：光致发光：光源化学发光：化学反应能量化学发光；原子发射光谱法化学发光：生物体释放的能量产生的生物发光：荧光荧光分析磷光分析；二、分子荧光分析的特点。1.高灵敏度的荧光强度随着光致发光强度的增加而增加(增加光致发光强度可以提高荧光强度；使用高灵敏度的检测系统可以大大提高灵敏度；检测限

2、荧光分析法比分光光度法低24个数量级；2.选择性好；不同的物质被不同的光激发；具有不同激发光波长的不同物质发出不同的荧光；通过选择不同的检测荧光波长，更容易消除其他物质的干扰；3.实验方法简单；4.仪器价格适中；它能定量测定多种微量无机和有机物质，测量范围广，发光强度高，广泛应用于生物化学、分子生物学、免疫学、农畜产品分析、卫生检疫等领域。荧光法比磷光法应用更广泛，磷光法不如分光光度法。5.2分子荧光和磷光的基本原理。首先，产生荧光和磷光。激发态分子在跃迁回基态的过程中以光子的形式辐射出多余的能量。这种现象被称为“发光”，单线态被激发：分子吸收能量后，在跃迁过程中自旋方向没有变化。S0、S1和

3、S2用来表示基态，即分子的第一和第二激发态。激发态：当一个分子吸收能量时，在跃迁过程中伴随着电子自旋方向的变化。T1和T2被用来代表分子的第一和第二个激发三元组。1.振动弛豫：是指在相同的电子能级下，电子从高振动能级到低振动能级的非辐射跃迁过程。2.内部转换：意味着当两个电子能级如此接近以至于它们的振动能级重叠时，将电子从高能级转移到低能级的非辐射跃迁过程经常发生。3。跨越：的不同多态之间的非辐射跃迁伴随着受激电子自旋态的变化，如S1T1。4。外部转换：受激分子通过与溶剂或其他溶质分子的相互作用转换能量，荧光或磷光强度降低或消失的过程。这种现象也被称为“淬火”或“淬火”。荧光发射当分子处于单线

4、态的最低振动能层时，去激发过程需要大约10-710-9s来发射光子回到基态。磷光发射：激发态分子在系统间交叉后跃迁到激发态三重态，然后在快速振动弛豫后达到第一激发态三重态(T1)的最低振动能级，并通过发射光子从T1态分子返回基态。磷光的寿命比荧光长得多。从图中可以看出，磷荧光*容易产生荧光，n *容易产生磷光。其次，固定激发光谱和发射光谱，固定荧光的最大发射波长，然后改变激发光的波长。根据测量的荧光强度与激发光波长的关系，得到激发光谱曲线。选择最大激发波长作为激发光波长，然后选择在di发射的荧光或磷光强度材料只吸收紫外线和可见光，并产生* n *跃迁和荧光。*与n *跃迁相比，摩尔吸收系数大，

5、寿命短。*跃迁通常产生强荧光，而n *跃迁产生弱荧光，但它能产生系统间跃迁和更强的磷光。通常，有机芳香化合物和金属离子络合物是最强和最有用的磷光体。第三，荧光与分子结构之间有一个共轭体系。环越多，共轭程度越大，产生的荧光波长越长，发出的荧光强度越强。1.共轭体系具有强荧光，芳香族化合物具有共轭不饱和体系，大多数能产生荧光的多环芳烃是重要的环境污染物。3，4-苯并芘可通过荧光方法确定为强致癌物，ex=386 nm em=430 nm。2.刚性平面结构是一种稳定的平面结构。大多数具有强荧光的分子具有刚性平面结构。荧光素：氧桥将两个环固定在一个平面上，平面结构。酚酞：厌氧桥固定两个环，不能共面。它是

6、一种非荧光物质。实施例1，2-二苯乙烯，反式：具有平面构型的强荧光物质，顺式：非平面构型。大多数无机盐金属离子不能产生荧光，但一些螯合物能产生强荧光，可用于痕量金属离子的测定。许多有机配体是弱磷光体或不发荧光，但与锰形成螯合物后，它们变成平面构型，这将增强荧光或产生荧光。实例：8-羟基喹啉是一种弱磷光体，在与Mn3和Mg2形成螯合物后，它可以形成刚性结构并增强荧光。它们可分为三类：(1)增强荧光的取代基包括-羟基、-或、-NH2、-NHR、-NR2等。因为该基团的n电子(孤对)的电子云平行于苯环上的轨道，共轭电子被共享，共轭体系扩大，荧光波长长时间偏移，荧光强度增强。(2)取代基-COOH、-

7、NO2、-COOR、-NO3、-SH减弱荧光，使荧光波长短移，并减弱荧光强度(3)取代基-NH3、-R、-SO3H等。(4)芳环上氟、氯、溴、碘的取代增强了体系间的跃迁，导致以下结果：荧光强度随卤原子重量的增加而降低，磷光相应增加。这种效应就是重原子效应。(5)对位和邻位取代增强了荧光，而间位取代抑制了荧光。(4)环境对荧光和磷光的影响(1)溶剂的影响同一种荧光物质在不同的溶剂中可能表现出不同的荧光性质。一般来说，溶剂的极性增加，荧光波长变长，荧光强度增加。(2)温度的影响低温测量提高了灵敏度，因为辐射跃迁速率基本不随温度变化，而非辐射跃迁速率随温度的升高而显著增加。随着溶液温度的升高，大多数

8、荧光物质的荧光效率和强度降低。温度对磷光有更大的影响。3.酸碱度的影响。大多数含酸性或碱性基团的芳香化合物的荧光性质受溶液酸碱度的影响很大。共轭酸碱对是具有不同荧光性质的两种类型，有各自的荧光效率和荧光波长。实例：苯酚，电离后，荧光消失，但在pH1有荧光，在pH13没有荧光。然而，两个苯环相连的化合物表现出相反的性质。分子形式是非荧光的，电离后显示荧光。例子：苯酚，有荧光和无荧光。此外，表面活性剂也会影响荧光强度和特性。4。荧光猝灭(荧光消光)，荧光物质分子与溶剂分子或其他溶质分子之间的相互作用导致荧光强度降低。降低荧光强度的物质称为荧光猝灭剂，并且(I)碰撞消光是荧光消光的主要原因。这意味着

9、在激发的单重态中的荧光分子M*之后能量转移是指处于激发单线态的荧光分子M*与猝灭剂之间的相互作用，这种相互作用导致猝灭剂被激发。反应如下。()复合化合物的猝灭指猝灭剂和荧光分子在基态的配位反应，产生非荧光络合物。自熄和自吸收当荧光物质的浓度很大时，经常发生自熄，这可能由于受激分子之间的碰撞而导致能量损失。如果荧光物质的吸收光谱和发射光谱有很大的重叠，荧光物质发出的一些荧光可能被它自己的基态分子吸收，这就是所谓的自吸收。随着荧光物质浓度的增加，自吸收现象将会加剧。5.荧光强度与荧光物质浓度的关系。当用强度为I0的入射光照射液体池中的荧光物质时，产生荧光。荧光强度是用仪器测量的。当荧光浓度非常低(

10、0.05)时，荧光物质发出的荧光强度If与浓度If=f Ia=f(I0-1)具有以下关系，Ia是吸收辐射强度I0是入射光强度。如果=f (I0-i010-a)=fi0 (1-10-a)，I=i010-a，则上述公式扩展。当0.05时，与第一个项目相比，方括号中的其他项目可以忽略。上述公式简化为If=2.3 f I0A=2.3 f I0 bc，当0.05时，当激发光的波长和强度不变时，f、I0和b组合为K If=KC Ip=KC。根据定量分析，荧光强度与物质浓度呈线性关系，只有当浓度较低时才能使用If=KC，荧光物质可以高灵敏度地测量痕量或痕量成分。当浓度较高时，If和c之间没有线性关系，有时c

11、增加，但If由于公式中后期的影响而减少，有时出现荧光猝灭效应。荧光分析仪主要由光源、单色仪、液体罐、探测器和显示器组成。光源、第一单色仪、液体罐、第二单色仪、探测器、放大器和记录器、EX和EM与分光光度计有两点不同。两个单色仪探测器与激发光成直角。适用于宽波长范围荧光光度计中常用的高压汞灯和氙弧灯，利用汞蒸气放电发光；最广泛使用的光源之一在365纳米、405纳米和436纳米发射三条谱线，最强的谱线在365纳米，可以在250800纳米发射强连续光源。和单色仪。大多数荧光光度计一般使用两个高分辨率的光栅单色仪，可以扫描光谱，获得激发光谱和荧光光谱。第一个单色仪功能：分离。第二单色仪的作用是滤除一些

12、杂散光和杂质发出的干涉光，从而选择荧光波长em进行测量。在选定的条件下，对荧光强度进行了测量和定量分析。3、包含测定溶液的样品池通常是由应时材料制成的正方形池，其四周透明，并且只能用手握住边缘或顶部。4.探测器将光信号转换成电信号，放大后直接转换成荧光强度。荧光强度通常较弱，这要求检测器具有高灵敏度。荧光光度计采用光电倍增管。荧光分析比吸收分光光度法具有更高的灵敏度，因为荧光强度与光致发光强度成正比，增加光致发光强度可以大大提高荧光强度。(2)磷光分析仪类似于荧光分析仪，主要区别如下：1 .样品室应在液氮温度(77K，-196 F)下测量低温磷光(将液体池放入装有液氮的杜瓦瓶中)；固体表面室温

13、磷光分析需要特殊的样品室2。用机械光切割装置的磷光镜区分荧光和磷光。利用短荧光寿命和长磷光寿命消除荧光干扰。(1)定量分析以相对荧光强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，5.4荧光和磷光分析及其应用。2 .荧光猝灭法，利用荧光猝灭进行定量分析，具有较高的灵敏度和选择性。如果荧光物质M和猝灭剂Q生成非荧光基态复合物MQ M Q=MQ(非荧光物质)，则可以推导出：加入猝灭剂前的荧光强度，加入猝灭剂后，荧光强度、常数、猝灭剂浓度、前/后I与C(Q)呈线性关系，即可得到猝灭剂含量。与标准曲线法相似，将一系列不同的猝灭剂Q加入到一定浓度的荧光体系中，制成荧光物质猝灭剂体系，然后在相同条件下测量其荧光强度。

14、得到一条曲线，取相同的荧光物质CM CM CM CM CM CM，加入不同量的qccq0cq1cq2ccq3cqx (cq0=0)，测量前、后、后2、后3，计算前/后1/前1/后1/后2、前/后1/后3、前/后1 x、3。比较方法很简单，如果样品数量很少，可以用比较方法来测量标准溶液的浓度，铯，它类似于未知溶液的浓度Cx，并在相同的条件下测定它们的荧光强度。未知溶液如果x=KCx标准溶液如果s=KCs，4。多组分混合物的荧光分析，(1)如果两种组分的荧光峰互不干扰，可以直接在各自的荧光波长下测定。计算它们的含量(2)如果两种组分的荧光峰相互干扰，但是激发光谱明显不同，一种组分在一定的激发光下产

15、生荧光峰，而另一种组分不产生荧光；Al3 8-羟基喹啉络合物的氯仿溶液ex=436nm em=520nm 365nm羟基喹啉络合物的氯仿溶液ex=436nm em=520nm 365nm激发光，Al3络合物产生荧光，而Ga3络合物不产生荧光且没有荧光峰。在436nm的激发光下，Ga3的复合物产生荧光，而Al3的复合物不产生荧光，并且在365nm没有荧光峰被激发。Al3 8-羟基喹啉的络合物在520纳米测量，在436纳米激发，Ga3 8-羟基喹啉的络合物在520纳米测量，例如：(3)如果两种组分的荧光光谱和激发光谱相互干扰，荧光强度的加性(F=F1 F2 F3)用于在适当的荧光波长下测量， 联立方程用于求解实例：硫胺素荧光CT ex=385nm em=435nm吡啶硫胺素荧光CP ex=410nm em=480nm，干涉荧光光谱重叠，385或410nm激发，分别在435和480nm测量荧光强度