免疫胶体金的制备(康柳英).ppt

1、免疫胶体金的制备,原理 制备过程 1.胶体金的制备 2.胶体金标记蛋白 3.胶体金标记蛋白的纯化,原理,氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液。由于静电作用而成为稳定的胶体状态，故称胶体金。胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。,一. 胶体金的制备,胶体金溶液制备的基本原理是向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子。使用不同种类、不同剂量的还原剂，可以控制所产生的胶体金粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还

2、原核的数量。还原剂浓度越高，核浓度也越高，氯化金的还原也就从更多的还原中心开始，因此产生的胶体金粒子数量越多，但体积也越小。,常用方法,1柠檬酸三钠还原法 2鞣酸柠檬酸三钠还原法 3. 白磷还原法 4. 抗体血酸还原法 5. 硼氢化钠还原法 6. 乙醇超声波还原法,步骤(柠檬酸三钠法),(1) 取5000ml圆底烧瓶一个，加4000 ml双蒸水及160 ml 1%氯化金，加热沸腾2-5分钟； (2) 根据需要准确加入不同量的2柠檬酸三钠水溶液，混匀，再保持沸腾5分钟，溶液颜色首先变黑，再逐渐变红，粒子体积较小时，溶液呈桔红色，而粒子体积较大时，则颜色偏向紫色。 (3) 冷却后以蒸馏水恢复到原体

3、积。,金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的，保持其他条件恒定，仅改变加入的柠檬酸三钠量，可制得不同颜色的金溶胶，也就是不同粒径的金溶胶，见附表,注意事项,（1）玻璃器皿必须彻底清洗，最好是经过硅化处理的玻璃器皿，或用第一次配制的胶体金稳定的玻璃器皿，再用双馏水冲洗后使用。否则影响生物大分子与金颗粒结合和活化后金颗粒的稳定性，不能获得预期大小的金颗粒 （2）试剂配制必须保持严格的纯净，所有试剂都必须使用双馏水或三馏水配制，或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜过滤，以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 （3）配制胶体金溶液的pH以中性（pH7.2）较好。 （4）氯金酸极易

4、吸潮，对金属有强烈的腐蚀性，不能使用金属药匙，避免接触天平称盘。 （5）胶体金溶液最好保存在4冰箱中；也可保存在室温下，一般可保存1-2个月。但决不可保存在0以下，否则金粒子发生凝聚。,二.胶体金标记蛋白的制备,1. 蛋白质的处理 2. 蛋白与胶体金结合最佳pH确定 3. 最小蛋白浓度的确定 4. 胶体金与蛋白质的结合 5. 胶体金标记蛋白的纯化,蛋白质的处理,目的: （1）去除高浓度的盐分，高浓度的盐分往往干扰蛋白与胶体金的吸附结合，或导致胶体金粒子的凝聚，这一步往往采用低浓度缓冲液中进行。 （2）使蛋白分子尽量分散为单体，冻干蛋白或高浓度蛋白溶液中蛋白分子往往凝聚为多聚体大分子，可同时与多

5、个胶体金粒子结合，影响标记的灵敏度和定量分析。 （3）使蛋白具有适当的分子量。蛋白分子量过小（30KD), 形成的蛋白复合体往往是不稳定，可短时间内失活。而分子量过大时，被认为影响探针的灵敏度，特别是已知蛋白的结构与活性中心的情况下，去除对活性武影响的结构部分是提高标记灵敏度，延长探针寿命（防止凝集）的有效办法。把分子量过小的蛋白与其它蛋白（如BSA，牛血清蛋白等）结合后，能制备出稳定性更佳的探针。,蛋白与胶体金结合最佳pH确定,1. 取若干个1.5ml试管，分别加入1 ml 胶体金 2. 用1% K2CO3将pH分别调为6，7，8，9，10；（20#管在7左右，实际中我们绝大部分是按变色点来

6、选） 3. 按pH从低到高分别加入20ul浓度为1 mg/ml的蛋白，混合，室温下放置15min； 4. 观察胶体金颜色变化，记录保持红色的最低pH,最小蛋白浓度的确定,1. 取若干个1.5ml试管，每个分别加入最佳pH的胶体金1 ml ； 2. 依次加入不同量的蛋白（一般浓度为0.5-1 mg/ml）120 ul，（一般抗体按10，15，20ug/ml;抗原按30，40ug/ml),混匀，室温下放置15min；(加验胶C20ul/ml看胶的颜色来确定） 3. 颜色仍保持红色的最小蛋白用量即最小蛋白浓度。,胶体金与蛋白质的结合,1. 用1% K2CO3调节金溶胶至所需pH。 2. 于100ml

7、 金溶胶中加入最佳标记量的蛋白质溶液，搅拌分钟,放置15min 。 3.加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀 。常用稳定剂是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD）。,胶体金标记蛋白的纯化,（1）超速离心法：根据胶体金颗粒的大小，标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 （2）凝胶过滤法：此法只适用于以BSA作稳定剂的胶体金蛋白结合物的纯化。,储存,离心后，仔细吸出上清，沉淀物用含1BSA的PB液（含0.02NaN3），将沉淀重悬为原体积的110，4保存。 如在结合物内加50甘油可贮存于-18保存一年以上。 贮存中可能会发生程度不同的凝聚，可离心除去

8、。,注意事项,1.有些蛋白最佳pH范围较窄，设置的梯度不能太大。 2.在实际的制备中，一般胶体金调整pH=PI+0.5，这样蛋白带正电，有利于结合更稳定。 3. 使用不同直径的胶体金与同一蛋白结合时，除了蛋白量完全不同外，往往最佳pH也有一定变化。 4. 不同直径胶体金所需离心速度完全不同。,氯化金极易吸湿，故一般均以小剂量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液时一次配完，暂时不用的可以用1.5 ml试管分装为1 ml保存（-20）。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗，有条件时可硅化处理（1双氯硅烷/氯仿浸泡1小时，烘干）。配制各种试剂时均使用双蒸水，随后再用0.22 mm

9、微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用，不用时应密封保存，以防污染。 制备好的胶体金保存寿命较长，可4保存6个月以上或室温下保存1-2个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何，在保存较长时间后应进行镜检，如出现大量胶体金粒子凝集，说明已经过期。,由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差，以及制备过程中的其它问题（加热时间，温度；倒液速度），胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差，因此，在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大，粒子凝聚，粒子边缘不清晰等问题，须重新制备。,试剂添加顺序 即把柠檬酸盐溶液加入氯金酸溶液还是把氯金酸加入柠檬酸溶液，这种添加次序对胶体质量有何影响，（试验）,不同直径胶体金所需离心速度完全不同。以绝大部分探针形成松散沉淀为原则。离心力太大，会产生不可逆的探针凝聚；离心力太小，探针无法沉下。最好能够直接用胶体金在不同转速下离心以确定适当的离心力。 3).在冷离心机中可适当延长离心时间，同时适当减小离心力，探针活性较好。 4).IgG的最佳交联pH有多种报导，从7.4-9.0。一般认为，7.4时胶体金结合的蛋白最多，9.0时制备的探针最稳定。,影响最终胶体金质量的因素 多种物理因素都会影