基因工程工具酶.ppt

1、，第12.2章，分子克隆酶，由山沈小兰生产，2。基因工程的操作是在分子水平上的操作，它依赖于一些酶(如限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等)。)作为手工切割、拼接和扩增基因的工具。所以这些酶被称为“工具酶”。工具酶是通过修饰和优化野生菌株(或真核生物，如酵母)生产的生物工程产品。一种用于基因工程的工具酶，由山制造。3.自然界的许多微生物中都有一些具有特殊功能的酶。这些酶参与微生物的核酸代谢，并在核酸复制和修复中发挥重要作用。一些酶还被用作微生物的防御工具，以区分自己的DNA和非自身DNA，并降解非自身DNA。在研究和掌握了利用这些酶进行基因切割和剪接的操作方法后，人类获得了最好的基因工程工具。

2、基因工程工具酶，由山沈小兰制造，4，12.2.1限制性内切酶12.2.2甲基化酶12.2.3脱氧核糖核酸连接酶12.2.4脱氧核糖核酸聚合酶12.2.5核糖核酸聚合酶12.2.6磷酸激酶和磷酸酶12.2.7核酸酶12.2.8核酶，基因工程12.2.1限制性内切酶，限制性内切酶活性单位的发现限制性内切酶切割特征限制性内切酶反应条件限制性内切酶的应用，山沈小兰，6 贝尔塔尼和韦格发现了细菌的限制现象：噬菌体(K)，大肠杆菌K，大肠杆菌B大肠杆菌B限制(K)，感染，非感染，限制性内切酶的发现，单沈小兰的生产，7，噬菌体感染细菌，L，单沈小兰的生产，大肠杆菌含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶。 当(

3、k)噬菌体感染大肠杆菌时，由于EcoB核酸酶在其DNA中特异性识别的碱基序列，它被降解。虽然大肠杆菌的DNA中也存在这一特定序列，但它能催化腺苷甲硫氨酸(SAM)将甲基转移到限制性酶识别序列的特定碱基上进行甲基化。EcoB核酸酶不能识别甲基化序列。9日，由丹沈小兰制成的少量噬菌体(K)仍能在大肠杆菌B中存活，因为大肠杆菌B经过噬菌体修饰(K)。大肠杆菌B、大肠杆菌K、修饰噬菌体(B)、修饰噬菌体(K)、10-4(限制性)、10-4(限制性)、1(修饰)，由单、10、制得，在细菌中有位点特异性限制性内切酶和特异性甲基化，R-M制是保持细菌安全不受外界影响的积极措施。细菌R-M系统的限制性内切酶能

4、降解脱氧核糖核酸。为了避免自身的脱氧核糖核酸降解，细菌可以修饰自身的脱氧核糖核酸，而未经修饰的外源脱氧核糖核酸将被降解。单个噬菌体在降解前已经被修饰，所以它们可以免于降解。11，限制性内切酶发现，1968 Linn和Arber从大肠杆菌B中发现限制性内切酶，1970 Smith从流感嗜血杆菌中发现限制性内切酶，1978 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因发现限制性内切酶并对其功能研究做出突出贡献而获得诺贝尔奖，由Shan沈小兰完成。12、限制性内切酶：一种能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列并在细胞中切割DNA分子的酶。功能：降解不同来源的DNA，但不能降解同源DNA。

5、由山沈小兰生产，13，限制性内切酶分类，由山沈小兰生产，14，限制性内切酶类型，由山沈小兰生产，15，eCOR 1，埃希氏菌，属名，大肠杆菌，种名，Ry13，菌株，号。如果种名的前两个字母相同，其中一个可用作种名的第一个，限制性内切酶的名称，丹沈小兰的生产，16，限制性内切酶的活性单位，50L缓冲液，含1g底物DNA，在最佳条件下保持该温度一小时，完全降解1g DNA所需的酶蛋白的量是一个酶单位缓冲液(酸碱度=8.0): 50毫摩尔/升Tris-HCl 10毫摩尔/升氯化镁1毫摩尔/升二苯并三氮唑或巯基乙醇100克牛血清白蛋白/毫升(滴滴涕：二硫苏糖醇牛血清白蛋白)，由山沈小兰，17，在双链D

6、NA分子的特异性识别序列位点，切割该DNA分子并断裂该链。两个单链断裂在DNA分子上的分布通常不是彼此直接相反的。断裂形成的DNA片段具有互补的单链延伸端。限制性内切酶的切割特性，单，18。识别序列，大多数类型的限制性内切酶可以识别由4-8个核苷酸组成的特定核苷酸序列。限制性内切酶从识别序列中切割DNA分子，因此这些识别序列也被称为内切酶切割位点或靶序列。有两种识别序列：连续的(如GATC)和不连续的(如甘特茨)，它们都是回文。由山制造，19，PST:不同核酸内切酶的特异性识别位点，由山制造，20，后切割位点，核酸内切酶后切割双链DNA分子，由山，21，三种切割末端，齐平末端(如Sma，Alu

7、，HAE)，5粘性末端(如ECOR)，5-G-AATTT进行相同的切割并形成相同的末端。例如，惠普和微软都可以削减CGG。当胞嘧啶甲基化时，Msp不能再切割。合成酶：不同的来源识别不同的核苷酸靶序列，但是切割的DNA分子产生具有相同粘性末端的限制性内切酶。由danlinna，23，BamH Bcl Bgl制造的，能够产生5-氨基-3-氨基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-3-基-基-，山，24，限制性内切酶的反应条件，1。底物脱氧核糖核酸(1)脱氧核糖核酸纯度：核糖核酸与大肠杆菌结合影响有效

8、酶浓度；(2):的DNA浓度过高，抑制了酶的活性并影响酶分子的扩散，如：4g DNA/1U HPA 50L 37 15h 1g DNA/1u HPA 50L 37 1h，由山沈小兰生产，25，1。底物脱氧核糖核酸；(3)识别位点和邻近位点的特定序列：例如，pBR322 DNA具有四个Nar切割点(GGCGCC)，其中另一个例子是Xma切点(CGGCCG)在GGCGGCCGCC时不切割。(4)脱氧核糖核酸的二级/三级结构：例如，超螺旋脱氧核糖核酸(病毒或质粒)比线性脱氧核糖核酸需要更多的酶。(5)提取过程中混合杂质会改变识别特异性，如Hg2、苯酚、氯仿、乙醇、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠、氯化钠

9、等。由丹沈小兰提出，26，限制性内切酶的反应条件，2。反应系统因素，(1)缓冲溶液(无菌和无污染)，和(2)金属离子：例如，1型酶需要Mg2，但如果用Mn2代替Mg2(如Hind和EcoRI)，特异性将改变。不适当的离子浓度会抑制酶的活性。(3)牛血清蛋白：牛血清蛋白是一种酶稳定剂，可避免因热、表面张力和化学物质引起的酶变性。过量的牛血清白蛋白会导致电泳拖尾，反应条件27、限制性内切酶3。起始活性和限制性酶识别特异性被放宽。EcoR通常识别待切割的GAATTC序列，但是如果缓冲液中甘油浓度超过5%，其识别位点会变松，切割可能发生在AATT。EcoR的这种特殊识别能力被称为恒星活动，由EcoR*

10、表示。恒星活动会导致不相等的分裂概率和不完全的降解。影响因素：甘油浓度12-20%，酶与脱氧核糖核酸之比，离子强度，45%聚乙二醇，有机溶剂，8%二甲基枫，二价阳离子，12%乙醇。Shan沈小兰，28岁，限制性内切酶的应用，重组DNA构建新质粒前切割，构建物理图谱DNA分子杂交，使用限制性内切酶消化受体DNA制备用于序列分析、基因定位、DNA同源性研究的DNA探针亚克隆，Shan沈小兰，29岁，酶促反应注意事项，昂贵，切勿用水稀释以避免变性和失活。除酶以外的所有其他试剂都是预先添加的。取酶，立即放在冰上。分开小份，以避免反复冷冻和解冻。使用无菌的新吸头。加入较少的水以使体积最小化，但确保酶溶液

11、的体积不超过总体积的10%，否则酶溶液中的甘油会抑制酶的活性。30岁的山制造，类系统由限制性内切酶和甲基化酶组成。大多数限制性内切酶都分离出相应的甲基化酶。甲基化酶，也称为修饰酶，用于修饰限制性酶的识别序列，并且在序列位点的胞嘧啶(C)的5-氨基上添加甲基，使得该序列可以被限制性酶识别而无需切割。12.2.2甲基化酶，由山生产，31。甲基化酶可分为两类：维持甲基化酶：一种用于新合成的DNA链甲基化的酶。甲基化位置与模板链上的相同。建设性甲基化酶：一种用于甲基化未甲基化的DNA链的酶。甲基化酶阻断了DNA链中的一些识别位点，保护了多余的限制性位点。为了构建新的限制性位点，丹沈小兰生产的32，12

12、.2.3脱氧核糖核酸连接酶可以催化脱氧核糖核酸中相邻的3-羟基和5-磷酸端之间形成3，5-磷酸二酯键，T4DNA连接酶可以连接具有匹配粘性端的脱氧核糖核酸分子，也可以连接具有平端的双链脱氧核糖核酸分子。大肠杆菌脱氧核糖核酸连接酶只能连接具有匹配粘性末端的脱氧核糖核酸分子，由丹沈小兰，33岁，aattc，g，gcttaa，aattc，g，gcttaa，5，5，5，5，(1) (2)，aattc，g，gcttaa，aattc，g，gct。(b)分子内连接，(1) (2)，at，g，c，t，a，ta，g，c，t，a，T4连接酶，T4连接酶，由山沈小兰，34，12.2.4脱氧核糖核酸聚合酶)，脱氧核糖

13、核酸聚合酶)脱氧核糖核酸聚合酶在脱氧核糖核酸复制中起关键作用。有三种主要类型的DNA聚合酶：聚合酶(pol)，它参与DNA修复并常用于基因工程；参与脱氧核糖核酸复制的聚合酶。由35岁的山沈小兰制造，比较脱氧核糖核酸聚合酶和脱氧核糖核酸聚合酶，由36岁的山沈小兰制造，需要模板(脱氧核糖核酸或核糖核酸)；需要底漆；它有三种酶活性，即53聚合酶活性；53个核酸外切酶活性和35个切除的核酸外切酶活性。DNA聚合酶的特性：由山制造，37，1) 53聚合酶活性：2)53核酸外切酶活性，3)35核酸外切酶活性，三种DNA聚合酶活性，由山制造，38，53聚合酶活性和53核酸外切酶活性的DNA聚合酶能使DNA一

14、体。利用这种反应，可以在体外用放射性磷(-32PdNTP)标记DNA片段来制作探针，这是现代分子生物学中的一项重要技术(见下图)。DNA聚合酶在DNA复制中的作用，由丹沈小兰提出，39，DNA聚合酶在DNA复制中的作用，由丹沈小兰提出，40，尼克翻译)，DNA，DNA聚合酶在分子克隆中的主要目的是通过DNA缺口翻译制备用于核酸杂交的放射性标记的DNA探针。5-3核酸外切酶活性，5-3聚合酶活性，未标记的核苷酸，标记的核苷酸，由丹沈小兰制造，41，DNA杂交探针的制备，53，35，53，35，* *，* *，(a)，(c) pol从5-P中除去一个核苷酸，(d) pol添加32P-标记的核苷酸来

15、替换除去的核苷酸，(e)重复步骤(c)和(d)，并且间隙在5-3个方向上移动，以形成由32P-标记的核苷酸合成的DNA链，由42岁的山沈小兰制造，探针，探针：用于探测标记物：可容易地检测的化合物与探针结合，这被称为标记物。分子杂交：探针DNA或RNA与被测物的互补组合称为分子杂交，由主要的DNA聚合酶，43岁的山沈小兰产生。DNA聚合酶(全酶)(大肠杆菌)克氏片段(大肠杆菌)TDNA聚合酶(tPHEGE感染的大肠杆菌TDNA聚合酶(tPHEGE感染的大肠杆菌)修饰的TDNA聚合酶(测序酶)TaqDNA聚合酶(耐热)DNA末端转移酶(不依赖于DNA)逆转录酶(依赖于核糖核酸)商业上使用的酶来自溶源性大肠杆菌，由噬菌体NM964整合。构建多肽链，分子量=109，000。活性5 3聚合，3 5和53切除。资料来源：大肠杆菌DNA聚合酶的大片段，由蛋白酶水解(Kleinow和Henningseon，1970)，脱氧核糖核酸，枯草