限制性核酸内切酶的命名和类型课件

1、第2章基因工程的酶学基础，第1节限制性内切酶第2节脱氧核糖核酸连接酶第3节脱氧核糖核酸聚合酶和逆转录酶第4节脱氧核糖核酸修饰酶第5节核酸外切酶第6节单链核酸内切酶第7节核酸酶：一种蛋白酶，它能切割两个相邻核苷酸残基之间的磷酸二酯键，从而导致核酸分子的多条核酸链的水解切割。基本概念及其生物学功能，特别是水解和断裂核糖核酸分子、脱氧核糖核酸酶特别是水解和断裂脱氧核糖核酸分子、脱氧核糖核酸酶非特异性酶、底物脱氧核糖核酸或核糖核酸、从核酸分子的末端一个接一个地降解核苷酸、从核酸分子内部调用核酸外切酶切断磷酸二酯键并将其断裂成小片段，称为核酸内切酶。通过水解来破坏核酸分子的方式是：而基因工程的操作是在分

2、子水平上的操作，它依赖于一些酶(例如限制性内切酶、连接酶、DNA聚合酶等)。)作为手工切割、拼接和扩增基因的工具。所以这些酶被称为“工具酶”。工具酶，1，限制性修饰系统2，限制性内切酶的命名和类型3，第二类限制性内切酶的基本特征4，影响限制性内切酶活性的因素5，限制性内切酶对DNA的消化第1节限制性内切酶，限制性内切酶是一种能够识别双链DNA分子中特定核苷酸序列(4-8bp)并从中切割双链DNA的内切酶，限制性内切酶概念，2。主要来源于原核生物的内切酶，即在核酸分子链上形成切口的酶。形成5-磷和3-羟基终端，自我保护，3。功能、细菌限制和改造系统(R/M系统)，1。来源，任何生物都有抵御外来物

3、质进入的机制，大肠杆菌B，大肠杆菌K、噬菌体(K B)，EOP=10-4(限制)即所谓的宿主控制限制和修饰现象简称为(R/M系统)。细菌的再生/再生系统类似于免疫系统，它能把自己的脱氧核糖核酸与外来的脱氧核糖核酸区分开来，并降解后者。宿主限制和修饰，大肠杆菌培养效率，EOP=1，限制性内切酶分解外来入侵细菌的DNA并将其切割成小片段。(1)限制，限制：实际上是限制酶降解外源DNA和维持宿主遗传稳定性的保护机制。细菌的DNA碱基受甲基化酶的甲基化修饰保护，不能被限制性酶识别和切割。(2)修饰)，Dam甲基化酶，GATC腺嘌呤N6位引入甲基，Dcm甲基化酶，CCAGG或CCGG序列在第二个C的C5

4、位引入甲基，修饰3360宿主细胞可通过甲基化识别自身的遗传物质和外源遗传物质。(3)限制与修饰系统相关的三个基因，hsd R:编码限制性内切酶，hsd M:编码限制性甲基化酶，hsd S:编码限制性内切酶和甲基化酶的共表达。这些酶可以识别DNA分子上的特定位点，并切断双链DNA。这些酶基于特定的DNA分子位点进行甲基化，从而可以修饰DNA。其作用是配合上述两种酶来识别特殊的作用位点。2。输入的噬菌体在大肠杆菌宿主细胞K株和B株中长时间生长，1)宿主细胞甲基化酶特异性保护染色体DNA和噬菌体DNA，2)自身产生的核酸内切酶识别位点被阻断(修饰)，以及1。大肠杆菌宿主细胞K株和B株有各自的限制和修

5、饰系统。限制和修饰的分子机制，3。当外来DNA入侵时，它被宿主限制性内切酶特异性降解。由于降解不完全，一些外源DNA分子在宿主细胞增殖过程中被宿主细胞甲基化酶修饰，尽管它们是外源性的，但并未被降解。5.当接受新宿主细菌的甲基化修饰时，它失去了原始宿主细菌的修饰标记，并失去了在原始宿主细胞中的生存力。在基因工程中，缺乏限制性的菌株应被用作受体。1.限制修改系统2。限制性内切酶的命名和类型。第二类限制性内切酶的基本特征。影响限制性酶活性的因素。限制酶对脱氧核糖核酸的消化。第一节限制性内切酶，命名系统由史密斯和拿但斯于1973年提出，命名原则如下：限制性内切酶的命名由三个字母组成，第一个字母为类名，

6、前两个字母为种名，大肠杆菌用Eco表示；流感嗜血杆菌由欣代表。2.如果酶存在于一个特殊的菌株中，在基本名称上加上菌株名称的第一个字母。如果酶的编码基因位于噬菌体(病毒)或质粒上，染色体外遗传成分用大写字母表示。例如，后：d株EcoR:耐药r质粒；3.如果在一个特定的菌株中有几种不同的限制和修复系统，罗马字母被用来表示在该菌株中发现某些酶的顺序。例如，在hind: d菌株中发现的第二种酶，4。除了上述名称外，所有限制性酶都应标有系统名称。限制性内切酶系统命名为R，甲基化酶命名为M。例如，R.Hind表示限制性内切酶M。Hind表示相应的甲基化酶。在实际应用中，R经常被忽略。eCOR 1，埃希氏菌

7、属，大肠杆菌属，种，Ry13，菌株，否。如果种的前两个字母相同，其中一个可以使用种的第一个和第三个字母。目前，已经鉴定了四种不同类型的限制性内切酶。根据识别和切割特性、催化条件以及限制性内切酶是否具有修饰的酶活性，可将其分为三种类型：和。限制性内切酶的类型2。限制性内切酶的类型根据识别和切割特性、催化条件以及限制性内切酶是否具有修饰的酶活性，可分为三种类型：和。用于基因工程，注：SAM为腺苷甲硫氨酸，1968年由麦塞尔森和袁从大肠杆菌B株和K株中首次分离得到。(1)识别位点序列，EcoB:TGA(n)8 TGT EcoK:AAC(n)6 gtgc，限制性内切酶的基本特征，如EcoB和EcoK。

8、非甲基化修饰的特定序列。n:表示任何一种需要三磷酸腺苷、镁和腺苷甲硫氨酸(S-腺苷甲硫氨酸)的核苷酸，(3)辅助因子，其在离特定识别位点约10001500 bp处随机切割单链，不产生特定片段，并且几乎没有应用。识别位点，切割，1-1.5kb，(2)切割位点分离的第一种酶是Hind未甲基化双链DNA上的特殊靶序列(主要是回文序列)，与DNA的来源无关。限制性内切酶的基本特征是：(1)识别位点序列，识别位点。切割双链DNA。形成粘性端或钝端。例如：(2)切割位点、甲、甲、乙、丙、丁、脱氧核糖核酸、脱氧核糖核酸反应需要三磷酸腺苷、镁和腺苷蛋氨酸。ecop1:agacc，ecop15:cagcag，它

9、们在基因工程操作中用处不大。限制性内切酶类型的基本特征，限制性内切酶类型，一类新鉴定的限制性内切酶。只有碱基被甲基化、羟甲基化和葡萄糖羟甲基化的DNA序列被切割。除了EcoKMcrBC，识别序列尚未确定，也尚未应用。核酸限制性内切酶的类型和主要特征。限制-修改系统2。限制性内切酶的命名和类型。第二类限制性内切酶的基本特征。影响限制性内切酶活性的因素。限制性内切酶对脱氧核糖核酸的消化。第一节限制性内切酶，识别序列，识别序列中碱基的数量一般为4-6 bp，有些识别较长，大多数识别位点具有旋转对称性(回文结构)，还有少数识别位点。4bp HPA c CGG hae cc5b pava g gwcc

10、ecor CCW gg 6bp bammg gattc smaccc GGG 11bp bg1 gcc nnnn nggc 12bp bstx ccan ntgc，1。以一对核苷酸为中心轴，相同数目的左右核苷酸相互互补。2.如果这两条DNA链以相同的方向阅读(例如5 3)，它们的核苷酸序列是相同的。5GAA TTC3 3CTT AAG5，有两个特点：回文序列：反向重复序列，双链DNA包含两个结构相同方向相反的序列，5GTNAC3 3CANTG5，限制性内切酶切割双链DNA，水解磷酸二酯键中的3-酯键产生两个末端，末端结构为5-P和3-OH，产生三个不同的切口。切割模式，与类型II核酸内切酶相关

11、的一些概念，内聚末端):具有单链末端结构，该结构具有由两条DNA单链上的不同(对称)消化位点形成的互补碱基，并且通过消化产生的两个内聚末端可以通过配对互补碱基容易地重新连接。钝端):是酶消化后形成的平端结构，因为酶消化位点在两条DNA单链上是相同的，并且这一端不容易重新连接。1。5个突出端，2个。3个突出的末端，I)不同的DNA双链，只要粘性末端是互补的，它们就可以连接。这比连接两个平齐端容易得多。粘性末端的含义，方便连接，ii)相同的DNA分子的内部连接，其可以通过两个相同的粘性末端连接成环状分子。粘性末端可以通过DNA聚合酶变平成齐平的末端。而B 3的末端可以通过末端转移酶加上几个多核苷酸

12、(如dA和dT)的尾部，也就是说，均聚物的尾部会造成人工粘性末端。A 5的末端可以用32P的DNA多核苷酸激酶标记。结束标记，3。平端、平端、连接困难、连接效率低，只有粘接端连接效率的1%，这种连接经常出现多重连接。连接粘性端和冲洗端的处理方法。)补充方法：使用DNA聚合酶将碱基补充到目标基因的粘性末端。)修剪(展平)方法使用核酸酶如S1和Bal31来切断靶基因粘性末端的单链突出部分，使其成为齐平末端。不同来源的酶识别相同的序列，并以相同或不同的方式切割。识别位点和切割点是相同的，如Hind和hsu 1，Hind 5-AAG CTT-33-TTC GAA-5hsu 1 5-AAG CTT-33

13、-TTC GAA-5，Isochizomer，完全Isochizomer:识别位点相同，但切割点不同。例如，圣诞一号和圣诞一号.不完全同溶酶：识别不同的序列，但能切掉相同的粘性末端。例如BamH I、Bgl、Bcl I、Xho等。5-ggatcc-3 3-cctagg-5，bamhi，bcl-1，5-tgatca-3 3-actagt-5，5-agatct-3 3-tctaga-5，bgl，5-ugatcy-3 Y代表嘧啶。等链体、5-GATC-33-CTAG-5、SAU3A和等链体粘性末端相互结合后形成的新位点不再能被原始酶识别。5-G 3-CCTAG、GATCT-3 A-5、BamH I、

14、Bgl、5-GGATCT-3、3-CCTAGA-5、BamH I、Bgl、Sau 3A、1。限制修改系统2。限制性内切酶的命名和类型。第二类限制性内切酶的基本特征。影响限制酶活性的因素。限制酶对脱氧核糖核酸的消化。第一节限制性内切酶1。标准酶水解体系的建立，限制性内切酶单位(u)的定义：在适当的温度和缓冲液下，在20l反应体系中完成1g DNA酶水解所需的酶量。，建议：酶略过量(2-5倍)和反应时间较长，反应条件为限制性内切酶，2。酶解过程中，与酶解系统混合终止酶解结果的鉴定、酶解系统一般为20l，在酶溶液体积不超过总反应体积10%的前提下，尽可能减少总反应体积。装载顺序一般为：ddH2O缓冲

15、液DNA酶，大多数II型核酸内切酶需要类似的反应条件：，混合后，用微型高速离心机进行短期离心，使管壁上的所有液体下沉。反应通过三种方法终止：(1)加入乙二胺四乙酸至最终浓度为10摩尔/升；加入十二烷基硫酸钠(SDS)至终浓度为0.1% (w/v)，在65加热20min或70加热10min)，用苯酚/氯仿萃取，鉴定酶解结果，用微琼脂糖凝胶电泳快速观察，然后决定是否终止反应。限制性内切酶的反应条件被完全消化：核酸内切酶的所有识别位点都被切割。局部消化：仅切除有限数量的消化部位。局部消化可以通过缩短培养时间、降低反应温度或减少酶用量来实现。酶消化后，发现除了靶DNA带外，还有其它带，导致非特异性裂解；不正确的操作会导致其他核酸内切酶的污染；其他的DNA污染可能存在于底物DNA中。电泳后，电泳带扩展，电泳带移动距离异常，底物DNA不纯；内切酶不纯；酶蛋白本身或其他外源蛋白与DNA结合，使电泳带异常移动。脱氧核糖核酸中的杂质，如蛋白质、多糖、苯酚、氯仿、乙醇、十二烷基硫酸钠、乙二