细胞培养(一)(1)

1、潘建平 教授浙大医学部病原生物学系,细胞培养（一）,潘建平： 办公室: 医学院科研楼C801室 办公室电话: 88206896 实验室：科研楼C805807室 Email: ,参考书,司徒镇强、吴军正. 细胞培养. 世界图书出版公司，2007 鄂征. 组织培养和分子细胞学技术. 北京出版社，2001 程宝鸾. 动物细胞培养技术.中山大学出版社，2006,一、细胞培养基础知识二、细胞培养准备技术三、细胞培养基本技术四、细胞培养的污染及控制五、细胞培养常见问题解答,组织（细胞）培养发展史年鉴,1878 Claude Bernard: 证明一个器官的生理系统在个体死亡以后仍然可以人工维持。 1885

2、 Wilhelm Roux: 在一个生理溶液中维持一块鸡胚的活性并观察其发育，从而证实该发育与鸡胚的其他部分无关。,1887 Ross Harrison: 利用凝固的青蛙淋巴液作为培养基，在体外培养青蛙神经嵴，维持其活性达数星期，并观察到了神经纤维的生长，从而解决了神经纤维的来源问题。Ross Harrison被人称为细胞培养之父。,1910 Burrows: 率先在血浆凝块中长期培养鸡胚细胞。 1911 Lewis: 以海水、血清、胚胎提取物、盐和蛋白胨为原料配制成了第一个人工的细胞培养液，并观察到了单层细胞的有限生长。 1916 Rous & Jones: 开创用胰酶来收获贴壁生长的细胞。

3、 1923-1931 Carrel: 研制T型培养瓶大规模培养细胞。 1927 Carrel & Rivera: 制造了第一个病毒疫苗牛痘疫苗。,1933 Gey: 发明了转管培养细胞的技术。 1948 Fisher: 研制成了第一个化学成分清楚的细胞培养液CMRL1006。 1952 Gey 和同事: 分离培养了HeLa细胞。 1952 Dulbecco: 发明了噬斑法，用长满的单层细胞检测病毒。,1954 Abercrombie: 观察到了体外培养细胞接触抑制的现象。 1961 Hatflick & Moorhead: 发现人成纤维细胞在一定的代数之后会死亡。 1965 Ham: 配制了第

4、一个无血清培养液。 1975 Khler & Milstein: 成功得到第一个用于单抗生产的杂交瘤细胞株。,一、细胞培养的基础知识(一)细胞培养的基本概念(二)细胞培养的应用(三)体外培养细胞的种类(四)体外培养细胞的生长方式及类型(五)体外培养细胞的生长过程(六)体外培养细胞的生长条件,细胞培养 将组织块用机械或消化的方法分散成单个细胞，用培养基制成单个细胞悬液，在体外适宜条件下进行培养生长。 细胞培养与组织培养、器官培养主要不同点： - 原始培养的对象不同 细胞培养：单个细胞悬液 组织培养：组织块（0.51 mm3）或薄片（厚 0.2 mm） 器官培养：器官原基/器官的一部分/整个器官,

5、(一) 细胞培养的基本概念,病毒学： 病毒分离培养及传代；研究病毒细胞间相互作用；抗病毒药物筛选 免疫学：单克隆抗体制备、免疫机制研究等 遗传学：研究基因功能；染色体基因图谱 生物医学工程：蛋白表达、抗体工程；药物安全性研究；生物相容性研究 分子细胞生物学：基因功能研究；细胞生物学行为研究 肿瘤学,(二) 细胞培养的应用,(三)体外培养细胞的种类,初代培养物/原代培养物 细胞系（cell line） 细胞株（cell strain）,初代培养物/原代培养物 即从供体取得的组织细胞在体外进行培养后的首次培养物。 初代培养物一旦进行传代培养后，就成为细胞系。 （传代培养：指将细胞从一个培养容器移植

6、到另一个培养容器中培养）,2. 细胞系（cell line） 初代培养物经首次传代成功后即成细胞系。包括： - 有限细胞系（finite cell line） 生存期有限的细胞系。不能继续传代或传代数有限 - 连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）,获无限繁殖能力能持续生存的细胞系。能连续传代。 大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 有的只有永生性，但仍保留接触抑制和无异体接种致癌性。 有的既有永生性，又有异体接种致瘤性，说明已恶性化。,3. 细胞株（cell strain） 通过筛选或克隆化从原代培养物或细胞系中获得

7、的具有特殊性质或标志的细胞。这些特性（有一定的标记染色体、特殊的抗原性等）在以后的培养中必须持续存在。包括： - 有限细胞株（finite cell line） 生存期有限的细胞株。不能继续传代或传代数有限 - 连续细胞株或无限细胞株（infinite cell line） 已获无限繁殖能力能持续生存的细胞株。能连续传代。 亚株（substrain） 由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群,二倍体细胞系或株 细胞群染色体数目具有与原供体二倍体细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75以上）的细胞群。在正常情况下具有限生命期，属有限细胞系。 随供体年龄和组织来源的不同，寿命长短各异。

8、- 人胚肺成纤维细胞可传4060代 - 人胚肾只有810代 - 人胚神经胶质细胞1530代 为保持二倍体细胞能长期被利用，一般在初代或25代即大量冻存作为原种（stock cells），用时再进行繁殖，用后再继续冻存，可供长期使用或延缓细胞的衰老。 假二倍体：仅数目相同，而核型不同，即染色体形态有改变者。,遗传缺陷细胞系或株 从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺陷细胞。这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。,肿瘤细胞系或株 是现有细胞系或细胞株中最多的一类，我国已建细胞系主要为这类细胞。肿瘤细胞系由癌瘤建成，多呈类上皮型细胞，常已传几

9、十代或百代以上，并具有不死性和异体接种致瘤性。,细胞系或细胞株的命名,HeLa： 为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）CHO： 中国仓鼠卵巢细胞（Chinese Hamster Ovary） 宫-743： 宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（National Institute of Health）建立；每3天传代，每次接种3105 细胞毫升。,细胞系或株的鉴定、管理和使用,ATCC（American type culture collection）入库细胞要求检测项目如下：,培养简历：组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等

10、 冻存液：培养基和防冻液名称 细胞活力：融解前后细胞接种存活率和生长特性 培养液：培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量,细胞形态：类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性 核型：二倍体或多倍体，有无标记染色体 无污染检测：包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等 物种检测：检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测 免疫检测：一两种血清学检测 细胞建立者：建立者姓名，检测者姓名,（四）体外培养细胞的生长方式及类型,体外培养细胞大多培养在瓶皿等容器中，根据它们是否能贴附在支持物上生长的特性，可分为： - 贴附生长型 - 悬浮生长型,贴附生长型

11、,必须贴附于支持物表面才能生长。大多数培养细胞贴附生长，属于贴壁依赖性细胞。 判断细胞形态时不能按照体内组织学标准判定，仅大致分成以下四型： 上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型 多型细胞型,1. 成纤维细胞型 胞体呈梭形或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。另外，凡培养中细胞的形态与成纤维细胞类似时皆可称之为成纤维细胞型。,名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织如：真正的成纤维 细胞、心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮 形态：似体内成纤维细

12、胞的形态，胞体梭形或不规则 三角形，胞质向外伸出23个长短不等的突起， 中有卵圆形核 生长特点：排列成放射状，漩涡状，并不紧靠连成片， 细胞细胞接触易断开而单独行动，游离的单独 的成纤维样细胞，常有几个伸长的细胞突起,成纤维细胞,2. 上皮型细胞 细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长时呈膜状移动，处于膜边缘的细胞总与膜相连，很少单独行动。起源于内、外胚层的细胞如皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝、胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。,名称：仅形态上似体内，实际上不完全相同 来源：来源于外胚层、内胚层细胞, 如： 皮肤及其衍生物,消化道，乳腺，肺泡, 上皮性肿瘤 形态：

13、类似体内的上皮细胞，扁平、不规则多角形，中有圆 形核 生长特点：易相连成片，相靠紧密相连成薄层铺石状 生长时呈膜状移动，很少脱离细胞群而单个活动,上皮型细胞,3.游走细胞型 来源于网状内皮系统的细胞，呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。 4.多型细胞型 有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。,悬浮型 于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于少数特殊的细胞，如某些癌细胞和血液白细胞。胞体圆形，不贴于支持物上，呈悬浮生长。这类细胞容易大量繁殖。,概念：培养时不贴附于底物而呈悬浮状态生长

14、 或以机械方法使保持悬浮状态下生长 来源：自血、脾或骨髓，尤其是血中白细胞、癌肿细胞 特点：在悬浮中生长良好细胞圆形，单个或小细胞团 优点：生存空间大，提供数量大，传代方便(不需消化)， 易于收获，可获得稳定状态 缺点：观察不方便，很多细胞不能悬浮生长(尤其是正常 细胞),Hepatocytes,单个细胞生长过程：细胞周期 培养细胞一代生长过程：生长曲线 细胞系生长过程：培养细胞生命期,（五）体外培养细胞的生长过程,1. 单个细胞的生长过程细胞周期（cell cycle）一个母细胞分裂结束后的细胞至其再分裂形成两个子细胞的这段时期，可分为间期和M（分裂期）两个阶段。 间期：细胞完成生长过程，D

15、NA合成 DNA合成前期：G1期 DNA合成期：S期 DNA合成后期：G2期 M期：细胞有丝分裂期 细胞周期间期(G1 期+S 期+G2 期)+M 期，可简称之为GSM 周期。,细胞周期时间（time of cell cycle, Tc） 完成一次细胞周期所需要的时间 Tc的长短与物种的细胞类型有关，不同类型细胞的G1长短不同，是造成Tc差异的主要原因 测定Tc的方法 标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）,小鼠十二指肠上皮细胞 10小时 人类胃上皮细胞 24小时，骨髓细胞18小时 培养的人成纤维细胞 18小时，CHO细胞14小时，HeLa细胞21

16、小时,标记有丝分裂百分率法（percentage labeled mitoses，PLM）,原理：对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。,待测细胞经3H-TdR标记后，所有S期细胞均被标记。 S期细胞经G2期才进入M期，所以一段时间内PLM=0。 开始出现标记M期细胞时，表示处于S期最后阶段的细胞，已渡过G2期，所以从PLM=0到出现PLM的时间间隔为TG2。,S期细胞逐渐进入M期，PLM上升，到达到最高点的时候说明来自处于S最后阶段的细胞，已完成M，进入G1期。所以从开始出现M到PLM达到最高点（100%）的时间

17、间隔就是TM。 当PLM开始下降时，表明处于S期最初阶段的细胞也已进入M期，所以出现PLM到PLM又开始下降的一段时间等于TS。 从PLM出现到下一次PLM出现的时间间隔就等于Tc，根据Tc=TG1+TS+TG2+TM即可求出的TG1长度。,事实上由于一个细胞群体中Tc和各时相不尽相同，第一个峰常达不到100%，以后的峰会发生衰减，PLM不一定会下降到零，所以实际测量时，常以（TG2+1/2TM）-TG2的方式求出TM。,细胞周期各阶段的时间与PLM的关系,传代：体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。当细胞增殖达到一定密度后，则需

18、要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存。,2. 培养细胞一代生长过程生长曲线,细胞“一代”：指培养细胞从细胞接种到分离再培养时的一段时间，这已成为细胞培养工作中的一种习惯说法，它与细胞倍增一代非同一含义。如某一细胞系为第153代细胞，即指该细胞系已传代153次。它与细胞世代（generation）或倍增（doubling）不同；在细胞一代中，细胞能倍增36次。,培养细胞生长曲线,以贴附型细胞为例： （1）潜伏期（latent phase） 细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结

19、束。贴附于支持物后的细胞，经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。 各种细胞贴附速度不同，与细胞种类、培养基成分和底物理化性质等密切相关。初代培养细胞贴附慢，可长达1024小时或更多；连续细胞系和恶性肿瘤细胞系贴附快，1030分钟即可贴附。,细胞处在潜伏期时，可有运动，基本无增殖，少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长，约2496小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅624小时；细胞接种密度大时潜伏期短。 当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入对数增生期。,（2）对数增生期（logarithmic growth phase） 是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。对数增生期细胞分裂相

20、数量可作为判定细胞生长旺盛与否的一个重要标志。 是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。,接触抑制 在接种细胞数量适宜情况下，对数增生期持续35天后，随细胞数量不断增多，生长空间渐趋减少，最后细胞相互接触汇合成片。细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（contact inhibition）。 恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区别正常与癌细胞标志之一。,密度抑制 细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少

21、，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制（density inhibition），导致细胞分裂停止。,判断细胞生长的指标： 对数生长期内细胞分裂活动的程度(增殖活性)可作为判断细胞生长是否旺盛的重要指标 有丝分裂指数(MI) 细胞群体倍增时间 细胞增殖活性测定： MTT法 标记核苷酸(3H-TdR)掺入法,有丝分裂指数(MI),指培养物中分裂相数量占全部细胞数量的百分比，统计时，每瓶至少需计数1000个细胞。 一般细胞的MI约为0.10.5%；原代培养物的MI比继代培养物低。连续细胞系和肿瘤细胞高，可达3%5%。,操作步骤 消化细胞，将细胞悬液接至内含盖玻片的培养皿中。

22、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟Giemsa液染色10分钟自来水冲洗。 盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 计算： 分裂指数=分裂细胞数/总细胞数100%,细胞群体倍增时间,培养物中细胞数量翻倍的平均时间 公式 TtLog2/Log(N/No) t：从接种到测细胞数的时间 N：时刻t测定的细胞数 No：接种的细胞数,MTT法,反映细胞内一种酶活性程度 MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下，生成蓝色的formazan结晶，fo

23、rmazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。 还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。,标记核苷酸(3H-TdR)掺入法：反映DNA,3H-TdR uptake (cpm),（3）停滞期（stagnate phase） 细胞数量达饱和密度后，细胞遂停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期（plateau）。停滞期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐

24、趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。 此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。传代过晚（已有中毒迹象）能影响下一代细胞的机能状态。在这种情况下，虽进行了传代，因细胞已受损，需要恢复，至少还要再传12两代，通过换液淘汰死细胞和使受损轻微的细胞得以恢复后，才能再用。,指细胞在培养中持续增殖和生长的时间 人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传3050代，相当于150300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡 如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代

25、只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变 正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致经历以下三个阶段：原代培养期、 传代期、衰退期,3. 细胞系的生长过程培养细胞生命期,（1）原代培养期从体内取出组织细胞接种培养到第一次传代阶段，一般持续14周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。原代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大，多呈二倍体核型，是检测药物很好的实验对象。 细胞群是异质的，细胞相互依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行培养时，细胞克隆形成率（cloning efficiency）很低，即细胞独立生存性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。,（2）传代期初代培养细胞一经传代后便改称为细胞系。在全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细