高效液相色谱柱基础知识

1、高效液相色谱柱基础知识，张润平，色谱柱结构，色谱柱由柱管、填料压盖、套圈(密封圈)、筛板(过滤器)、接头、螺杆等组成。柱管大多由不锈钢制成，当压力不高于70千克/平方厘米时，也可使用厚壁玻璃或石英管。为了提高柱效率和减少管壁效应，管的内壁要求高度光滑，不锈钢柱的内壁大部分是抛光的。筛板安装在色谱柱两端的柱连接处，根据填料的粒径，筛板为烧结不锈钢或钛合金，孔径为0.220米(510米)，以防止填料泄漏。根据分类分析的目的，类型常规分析柱，内径25毫米(常用4.6毫米，国产4毫米和5毫米)，柱长1030厘米，粒径3.5或5米；窄直径柱(也称为半微柱)，内径12毫米，柱长1020厘米；内径为0.20

2、.5毫米的毛细管柱(也称为微柱)；内径为5毫米的制备型半制备柱；实验室预制柱，内径2040毫米，柱长1030厘米；生产制备柱的内径可达几十厘米。按分离机理分类吸附型色谱柱化学键合相色谱柱(分配型)反相键合相色谱柱离子交换色谱柱凝胶亲和色谱柱手性色谱柱，色谱柱类型，色谱柱类型，按填料分类基质硅胶是高效液相色谱填料中最常见的基质。具有高强度，在溶剂中不会收缩或膨胀。它可以提供一个含有游离硅羟基的表面，并且可以通过硅烷化技术与各种配体键合，以制备用于正相、反相、离子交换和分子排阻色谱的填料。适用于各种极性和非极性溶剂。缺点是它不稳定，容易溶解在碱性水溶性流动相中。以高交联度苯乙烯-二乙烯苯或聚甲基丙

3、烯酸酯为基体的球形填料是高分子聚合物中常用的填料。压力极限低于无机填料的压力极限。色谱柱在整个酸碱度范围内稳定，可用氢氧化钠或强碱清洗；当流动相发生变化时，聚合物基体会膨胀或收缩，小分子化合物的柱效较低；主要用于大分子化合物，常制成凝胶柱或离子交换柱。定义：有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上形成的固定相称为化学键合相。非极性键合相类型(反相):键合相的表面基团是非极性羟基，如C18、C8、C3、乙基、甲基和苯基。中等极性的键合相：醚和二羟基键合相是常见的，根据流动相的极性，它们可以用作反相色谱的正相和固定相。极性键合相(正常相):通常使用氨基、氰基和二醇键合相。化学键合相色谱

4、柱的合成。化学键合相通常是以颗粒状多孔硅胶为基质，用烷烃二甲基氯硅烷或烷烃氯硅烷与硅胶表面的游离硅羟基反应形成硅氧硅碳键单分子膜而制备的。由于空间效应和其他因素的影响，约40.5%的硅烷醇基未反应。残留的硅羟基会降低非极性键合相表面的疏水性，并在极性溶质(尤其是碱性化合物)上产生二次化学吸附，从而使保留机理复杂化，使碱性组分的峰形变得拖尾。化学键合相色谱柱的合成，端基密封：为了最大限度地减少残留的硅烷醇基，键合反应后，通常用三甲基氯硅烷(TMCS)钝化，称为端基密封，以提高键合相的稳定性和尾部剥离。结合相的结合量通常用碳含量(C%)或覆盖率来表示。覆盖率：指参与反应的硅羟基数目与硅胶表面硅羟基

5、总数的比率。除硅碳杂化硅胶外，硅胶的酸碱度范围基质的颗粒分布越宽，柱效率越低(渗透性差)。基质的颗粒形状为球形：柱效高，重现性好，床层结构均匀无定型(不规则形状):床层结构不均匀，流动相线速度不均匀，谱带扩大。化学键合相色谱柱的性能、基质的平均孔径/孔体积、平均孔径与被测物质分子量的关系、化学键合相色谱柱的性能、较高的碳含量、较长的保留时间、较高的碳含量有利于难以保留的化合物的分离和水解稳定性，良好的重现性有利于极性化合物的拖尾， 低碳含量的提高有利于中性和碱性化合物的分析，减少溶剂损失，化学键合相色谱柱的性能和硅胶的活性主要影响碱性化合物的保留行为，活性高，保留时间长。 不同的加工温度和不同

6、的硅胶活性是选择性差异的主要来源。硅胶杂质含量低，重金属含量低，硅羟基活性小。尾矿减少是色谱柱质量的重要指标。启封端基会使碱性化合物尾部。备注：在流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残留硅烷醇基之间的强相互作用，减少或消除峰拖尾现象。因此，有机胺(如三乙胺)也被称为尾部还原剂。化学键相柱的性质和键合相的极性：非极性、中等极性和极性键合相的烷基链长度对样品容量、溶质保留值和分离选择性有影响。样品容量随着烷基链长度的增加而增加，长链烷基可以增加溶质保留值，并经常提高分离选择性。短链烷基键合相覆盖率高，极性化合物分离时可获得对称性好的色谱峰。苯基键合相和短链烷基键合相的性质相似。长链烷基保护硅胶基质

7、，C18柱具有高稳定性。C18基团的空间体积越大，有效孔径越小，分离大分子化合物时柱效率越低。化学键合相色谱柱的性能、嵌入极性基团的键合相的性能(SymmetryShield RP、Bound-RP)、化学键合相色谱柱的性能、屏蔽带电的硅羟基、减少碱性物质的保留、减少拖尾、改善与水的润湿性、无疏水塌陷、使用高比例水流动相时性能稳定、反相键合相色谱，适用于分离非极性至中等极性的分子化合物。衍生的反相离子对色谱和离子抑制色谱可以分离离子化合物，如有机酸、碱和盐。样品容量随着烷基链长度的增加而增加，长链烷基可以增加溶质的保留值，并经常提高分离的选择性。短链烷基键合相具有较高的覆盖率，极性化合物分离时可以得到对称性好的色谱峰。苯基键合相和短链烷基键合相的性质相似。流动相是极性水或缓冲溶液，并且经常加入可与水混溶的有机溶剂，例如甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮和四氢呋喃，以调节保留时间。如果极性大，保留时间短，首先洗脱。分离机理：无溶剂理论、反相键合相色谱和正相键合相色谱适用于分离中等极性和高极性化合物(如酚类、胺类、羰基和氨基酸等)。)。氰基键合对双键异构体或双键数目不等的环状化合物的分离具有更好的选择性。氰基键合相分离的选择性与硅胶相似，极性小于硅胶。在相同条件下，相同组分的保留时间小于硅胶。氨基键合相具有很强的氢键能力，对甾体、强心苷等多功能化